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    間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)黃連解毒湯中黃芩苷在大鼠腦脊液中的分布

    2020-06-08 06:38:30劉佳星趙琰王蘇娜王曉克羅娟孔慧
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年4期
    關(guān)鍵詞:黃連黃芩標(biāo)準(zhǔn)溶液

    劉佳星 趙琰 王蘇娜 王曉克 羅娟 孔慧

    黃連解毒湯最早源于葛洪《肘后備急方》卷二“治傷寒時(shí)氣溫病方第十三”,但未出方名[1],距今1700多年的歷史,是清熱解毒的經(jīng)典方劑[2]。其異名在《脈因證治》上稱火劑湯、《醫(yī)學(xué)心悟》中稱三黃解毒湯。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥材按3∶2∶2∶3比例配伍組成,以黃連瀉心火兼瀉中焦之火為君,黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣,黃柏瀉下焦之火,梔子通瀉三焦之火、導(dǎo)熱下行,合為佐使,共收瀉火解毒之功,用治大熱煩躁,口燥咽干,錯(cuò)語(yǔ)不眠;或熱病吐血、衄血;或熱甚發(fā)斑,或身熱下利,或濕熱黃疸;或外科癰瘍疔毒,小便黃赤,舌紅苔黃,脈數(shù)有力。無(wú)論內(nèi)服、外服,均有良好的治療作用[3-4]。

    黃連解毒湯的現(xiàn)代研究表明,它對(duì)多種感染性疾病[5]、內(nèi)分泌代謝性疾病以及一些免疫系統(tǒng)疾病[6]都有良好的臨床療效。對(duì)于缺血性中風(fēng)[7]、頸動(dòng)脈斑塊[8]、阿爾茨海默病、2型糖尿病[9]等亦有很好的治療作用。

    藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究在一定程度上揭示了黃連解毒湯中黃芩苷的作用機(jī)理,但是相對(duì)而言,黃連解毒湯治療腦部中風(fēng)和一些神志方面的疾病時(shí),是否對(duì)靶部位有直接作用、其有效成分是否可以透過(guò)血腦屏障、在腦中的代謝情況又是如何等問(wèn)題至今未見報(bào)道。藥物到達(dá)靶部位是藥物起效的關(guān)鍵方式之一,這其中已有研究表明梔子苷可以透過(guò)血腦屏障[10],通過(guò)抗氧化[11-12]等方式改善腦缺血導(dǎo)致的一些癥狀,那么黃芩苷作為黃連解毒湯中黃芩的主要成分之一,是否也能夠透過(guò)血腦屏障直接對(duì)腦部產(chǎn)生作用,是本實(shí)驗(yàn)需要解決的問(wèn)題。

    因此本論文在大鼠灌胃給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別抽取腦脊液,用icELISA法檢測(cè)黃芩苷在腦脊液中的含量,用以觀察黃連解毒湯中黃芩苷在腦脊液中的代謝情況,在一定程度上可以反映黃連解毒湯在腦部的分布特征。

    1 材料與方法

    1.1 儀器設(shè)備

    HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd);96孔酶標(biāo)板(NVNC丹麥賽默飛公司);酶標(biāo)儀(BioTek美國(guó)博騰儀器有限公司ELx800酶標(biāo)儀)。

    1.2 試劑

    黃連解毒湯制備藥材購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司,黃芩苷對(duì)照品(Shanghai Standard Biotech Co,Ltd批號(hào):1596/10595,純度≥98.0%);其他相關(guān)藥品如碳酸鹽和Tween-20等均為國(guó)產(chǎn)分析純;酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG,GeneScript公司);四甲基聯(lián)苯胺(TMB,美國(guó)Amercso公司)。

    1.3 樣品制備

    黃連解毒湯的制備按黃連解毒湯的處方比例,分別稱取黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥材各90 g、60 g、60 g、90 g,加水6倍量,煎煮三次,每次1.5小時(shí),濾過(guò),濾液濃縮至稠膏(1.37 g/mL原藥材)。

    1.4 樣品采集

    50只Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(220±10)g,雄性,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

    將健康的SD大鼠隨機(jī)分為5組,分別是1小時(shí)組、2小時(shí)組、3小時(shí)組、4小時(shí)組,每組6只,以及空白組26只,進(jìn)行試驗(yàn)。

    給藥劑量:SD大鼠按人公斤體重的6倍量進(jìn)行折算,為了保證在腦部組織能夠檢測(cè)出黃芩苷,大鼠的給藥劑量是折算劑量的5倍,每只大鼠灌胃2.5 mL。

    實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12小時(shí),將制備好的黃連解毒湯灌胃給藥,分別于給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)抽取腦脊液。

    腦脊液抽?。翰捎檬殖执笫箢^部固定體位的腦脊液抽取方法。將大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉,麻醉后將頭頸部所需部位鼠毛剃除干凈,參照任長(zhǎng)虹報(bào)道大鼠腦脊液抽取方法并進(jìn)行改進(jìn)[13],將大鼠的頭部按角度固定在腦固定儀上,采樣者手持1 mL注射器進(jìn)針,進(jìn)針角度與頭部成約135°角。針尖坡面向上緩慢向前進(jìn)針到小腦延髓池,深度約為0.5 cm。緩慢抽取80~100 μL腦脊液后迅速退針,將腦脊液注入1.5 mL的EP管中,置-40℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫笫筇幩馈?/p>

    1.5 icELISA法檢測(cè)黃芩苷

    1.5.1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取黃芩苷約5 mg,PBS溶解,配成100 μg/mL的母液。取母液50 μL,加腦脊液稀釋至10 μg/mL,然后用腦脊液依次5倍稀釋,直至稀釋到3.2 ng/mL,獲得濃度范圍從3.2~2000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    1.5.2 icELISA檢測(cè)步驟 實(shí)驗(yàn)前所有試劑室溫平衡30分鐘;用CBS(碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L,pH為9.6)稀釋包被原BAL-BSA(1∶5000),以100 μL/孔包被到96孔板,37℃孵育2小時(shí),用PBST洗板4次后,再用脫脂奶粉(5 g溶于100 mL去離子水中)250 μL/孔封閉。放入4℃冰箱過(guò)夜,PBST洗版3次,備用。

    向包被好的96孔微孔板中加入待測(cè)樣品或黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL/孔,空白孔加入等量空白腦脊液,放入37℃溫箱孵育1小時(shí),取出后PBST洗板3次;以黃芩苷對(duì)照品質(zhì)量濃度為0的測(cè)定孔為陽(yáng)性對(duì)照孔,加入以PBS按照1∶10000稀釋的酶標(biāo)二抗,每孔100 μL,于37℃溫箱孵育30分鐘;取出后用PBST洗板3次,每孔加入100 μL的TMB顯色液,37℃溫箱顯色15分鐘;以2 mol/L硫酸溶液50 μL/孔終止反應(yīng)。將整塊微孔板置于酶標(biāo)儀,測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度A值。

    1.6 方法學(xué)考察

    1.6.1 線性關(guān)系 取以上配制的濃度范圍從3.2~2000 ng/mL系列黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上icELISA檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,以A/A0(A0為空白孔OD值,A為檢測(cè)孔OD值)為y軸,黃芩苷濃度的自然對(duì)數(shù)為x軸,建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,計(jì)算線性范圍。

    1.6.2 精密度 取以上標(biāo)準(zhǔn)溶液中400 ng/mL、80 ng/mL和3.2 ng/mL 3個(gè)濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照以上的icELISA檢測(cè)步驟進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔,每條標(biāo)曲用1塊板測(cè)定,得出板間精密度。

    1.6.3 回收率 在空白大鼠腦脊液中定量加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品,配制成濃度為400 μg/mL、80 μg/mL和3.2 μg/mL的黃芩苷腦脊液溶液,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔檢測(cè)?;厥章视?jì)算公式如下:回收率=(黃芩苷檢測(cè)濃度/黃芩苷加入濃度)×100%。

    1.6.4 樣品檢測(cè) 取腦脊液室溫溶解,置高速離心機(jī)內(nèi)10000 rpm,離心4分鐘,溫度4℃,取上清液,加入包被好的96孔板,按以上檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 線性關(guān)系

    以A/A0(A0為空白孔OD值,A為檢測(cè)孔OD值)為Y軸,黃芩苷濃度的自然對(duì)數(shù)為X軸,建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,線性擬合回歸方程為:y=0.1069ln(x)+1.0144,R2=0.9885。見圖1。

    圖1 黃芩苷在腦脊液中的線性關(guān)系

    2.2 精密度

    通過(guò)檢測(cè),得出精密度見表1。從表1可以看出,小鼠腦脊液中高、中、低3種濃度黃芩苷含量檢測(cè)的精密度分別為13.14%、6.65%、6.04%,數(shù)據(jù)均≤15%,能夠滿足檢測(cè)需求。

    表1 icELISA法測(cè)定不同濃度黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度

    2.3 回收率

    按照回收率計(jì)算公式:回收率=(黃芩苷檢測(cè)濃度/黃芩苷加入濃度)×100%,測(cè)得結(jié)果見表2。從表2可以看出,檢測(cè)高、中、低3個(gè)濃度血漿溶液中黃芩苷的回收率分別為91.35%、87.04%和117.67%(SD≤15%),均在±20%之內(nèi),可以滿足生物樣品的檢測(cè)要求。

    表2 icELISA法測(cè)定不同濃度黃芩苷血漿溶液中標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率

    2.4 樣品檢測(cè)

    從給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)腦脊液中黃芩苷的平均含量可以看出,在給藥2小后黃芩苷在大鼠腦脊液中含量達(dá)到峰值,隨后下降,且下降速度較快,在給藥4小時(shí)后腦脊液中黃芩苷含量最低。見表3。

    表3 黃芩苷在腦脊液中的藥物分布經(jīng)時(shí)表

    3 討論

    黃連解毒湯在治療多種腦部疾病方面有著切實(shí)的臨床療效,其中黃芩苷(7-O-β-D葡萄糖醛酸)作為黃芩的主要有效成分發(fā)揮著重要作用。目前黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)研究的主要檢測(cè)手段是高效液相色譜法和質(zhì)譜法等,但是由于這些方法的樣品需要純化等前處理步驟,對(duì)采樣量需求較大,難以完成中藥復(fù)方在腦脊液中的含量檢測(cè),這也是一直未見報(bào)道黃連解毒湯主要成分黃芩苷在腦積液中分布的原因。本實(shí)驗(yàn)從每只大鼠中每次只能獲得100 μL左右的腦脊液,樣品離心后就可以直接用于檢測(cè),不需要進(jìn)行除蛋白等前處理程序,所以才具有了開展此項(xiàng)研究的可能性。

    本實(shí)驗(yàn)室前期自制了黃芩苷單克隆抗體,并對(duì)抗體的特異性等進(jìn)行了檢測(cè),如果將制備的黃芩苷單抗對(duì)黃芩苷的交叉反應(yīng)率定為100%,結(jié)果與黃連解毒湯中含有的主要成分梔子苷、葛根素、大豆苷等的交叉反應(yīng)率均<0.10%,表明此抗體的特異性良好[14]。而且,黃芩苷在胃腸道幾乎不被吸收,需要轉(zhuǎn)化成黃芩素吸收入血,但是在進(jìn)入血液后又被還原成黃芩苷,故在血液和組織中檢測(cè)到的仍然是黃芩苷[15]。另外,本實(shí)驗(yàn)室基于黃芩苷單克隆抗體建立的ELISA檢測(cè)方法,與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致,詳見蘇歆等在《藥物分析雜志》的報(bào)道[16]。

    鑒于中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和樣品含量相對(duì)較低的特點(diǎn),其組織分布研究一般是取給藥后某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織進(jìn)行檢測(cè)。雖然像HPLC-MS/MS這種高端儀器設(shè)備已經(jīng)普遍應(yīng)用于中藥藥代和組織分布的研究,但是其對(duì)樣品的制備較為嚴(yán)格和繁瑣,限制了其開展廣泛的研究。icELISA法具有特異性高、樣品處理簡(jiǎn)單、樣品用量少(50 μL就可以滿足檢測(cè)量的需求)、靈敏度高(與液質(zhì)聯(lián)用的靈敏度相當(dāng))、檢測(cè)時(shí)間快、樣品處理量大、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn),非常適合中藥復(fù)方的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究。本實(shí)驗(yàn)在以往黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)的研究基礎(chǔ)上,對(duì)采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)了給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn),既能反應(yīng)黃芩苷在腦部分布的經(jīng)時(shí)特征,又沒有犧牲大量動(dòng)物。

    在臨床實(shí)踐中,有時(shí)用腦脊液藥物濃度水平作為藥物腦組織穿透力的證據(jù),甚至有時(shí)用腦脊液藥物濃度代替感染部位的藥物濃度預(yù)測(cè)療效[17]。但腦脊液的提取具有一定難度,所以研究相對(duì)較少。大量研究表明,黃芩苷對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[17],但黃芩苷是否可以透過(guò)血腦屏障到達(dá)作用的靶部位,至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用icELISA檢測(cè)法首次從腦脊液中檢測(cè)到了黃芩苷,對(duì)黃芩苷能夠透過(guò)血腦屏障提供了直接的證據(jù)。

    通過(guò)實(shí)驗(yàn),作者證明了黃芩苷可以通過(guò)血腦屏障。結(jié)合現(xiàn)有研究認(rèn)為黃芩苷對(duì)缺血性腦中風(fēng)的保護(hù)作用可能與抗氧化、抗炎、抗興奮性毒性和促進(jìn)神經(jīng)再生作用有關(guān)[18]。因此,本研究為黃連解毒湯治療中風(fēng)等疾病的臨床應(yīng)用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為日后治療腦病疾病合理用藥提供了依據(jù)。

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