間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)黃連解毒湯中黃芩苷在大鼠腦脊液中的分布

劉佳星 趙琰 王蘇娜 王曉克 羅娟 孔慧

黃連解毒湯最早源于葛洪《肘后備急方》卷二“治傷寒時(shí)氣溫病方第十三”，但未出方名[1]，距今1700多年的歷史，是清熱解毒的經(jīng)典方劑[2]。其異名在《脈因證治》上稱火劑湯、《醫(yī)學(xué)心悟》中稱三黃解毒湯。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥材按3∶2∶2∶3比例配伍組成，以黃連瀉心火兼瀉中焦之火為君，黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣，黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火、導(dǎo)熱下行，合為佐使，共收瀉火解毒之功,用治大熱煩躁，口燥咽干，錯(cuò)語(yǔ)不眠；或熱病吐血、衄血；或熱甚發(fā)斑，或身熱下利，或濕熱黃疸；或外科癰瘍疔毒,小便黃赤，舌紅苔黃，脈數(shù)有力。無(wú)論內(nèi)服、外服，均有良好的治療作用[3-4]。

黃連解毒湯的現(xiàn)代研究表明，它對(duì)多種感染性疾病[5]、內(nèi)分泌代謝性疾病以及一些免疫系統(tǒng)疾病[6]都有良好的臨床療效。對(duì)于缺血性中風(fēng)[7]、頸動(dòng)脈斑塊[8]、阿爾茨海默病、2型糖尿病[9]等亦有很好的治療作用。

藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究在一定程度上揭示了黃連解毒湯中黃芩苷的作用機(jī)理，但是相對(duì)而言，黃連解毒湯治療腦部中風(fēng)和一些神志方面的疾病時(shí)，是否對(duì)靶部位有直接作用、其有效成分是否可以透過(guò)血腦屏障、在腦中的代謝情況又是如何等問(wèn)題至今未見報(bào)道。藥物到達(dá)靶部位是藥物起效的關(guān)鍵方式之一，這其中已有研究表明梔子苷可以透過(guò)血腦屏障[10]，通過(guò)抗氧化[11-12]等方式改善腦缺血導(dǎo)致的一些癥狀，那么黃芩苷作為黃連解毒湯中黃芩的主要成分之一，是否也能夠透過(guò)血腦屏障直接對(duì)腦部產(chǎn)生作用，是本實(shí)驗(yàn)需要解決的問(wèn)題。

因此本論文在大鼠灌胃給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別抽取腦脊液，用icELISA法檢測(cè)黃芩苷在腦脊液中的含量，用以觀察黃連解毒湯中黃芩苷在腦脊液中的代謝情況，在一定程度上可以反映黃連解毒湯在腦部的分布特征。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

HC-2518R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.，Ltd)；96孔酶標(biāo)板(NVNC丹麥賽默飛公司)；酶標(biāo)儀(BioTek美國(guó)博騰儀器有限公司ELx800酶標(biāo)儀)。

1.2 試劑

黃連解毒湯制備藥材購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司，黃芩苷對(duì)照品(Shanghai Standard Biotech Co，Ltd批號(hào)：1596/10595，純度≥98.0%)；其他相關(guān)藥品如碳酸鹽和Tween-20等均為國(guó)產(chǎn)分析純；酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，GeneScript公司)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB，美國(guó)Amercso公司)。

1.3 樣品制備

黃連解毒湯的制備按黃連解毒湯的處方比例，分別稱取黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥材各90 g、60 g、60 g、90 g，加水6倍量，煎煮三次，每次1.5小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏(1.37 g/mL原藥材)。

1.4 樣品采集

50只Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(220±10)g，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

將健康的SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別是1小時(shí)組、2小時(shí)組、3小時(shí)組、4小時(shí)組，每組6只，以及空白組26只，進(jìn)行試驗(yàn)。

給藥劑量：SD大鼠按人公斤體重的6倍量進(jìn)行折算，為了保證在腦部組織能夠檢測(cè)出黃芩苷，大鼠的給藥劑量是折算劑量的5倍，每只大鼠灌胃2.5 mL。

實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12小時(shí)，將制備好的黃連解毒湯灌胃給藥，分別于給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)抽取腦脊液。

腦脊液抽?。翰捎檬殖执笫箢^部固定體位的腦脊液抽取方法。將大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，麻醉后將頭頸部所需部位鼠毛剃除干凈，參照任長(zhǎng)虹報(bào)道大鼠腦脊液抽取方法并進(jìn)行改進(jìn)[13]，將大鼠的頭部按角度固定在腦固定儀上，采樣者手持1 mL注射器進(jìn)針，進(jìn)針角度與頭部成約135°角。針尖坡面向上緩慢向前進(jìn)針到小腦延髓池，深度約為0.5 cm。緩慢抽取80～100 μL腦脊液后迅速退針，將腦脊液注入1.5 mL的EP管中，置-40℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫笫筇幩馈?/p>

1.5 icELISA法檢測(cè)黃芩苷

1.5.1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取黃芩苷約5 mg，PBS溶解，配成100 μg/mL的母液。取母液50 μL，加腦脊液稀釋至10 μg/mL，然后用腦脊液依次5倍稀釋，直至稀釋到3.2 ng/mL，獲得濃度范圍從3.2～2000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.2 icELISA檢測(cè)步驟 實(shí)驗(yàn)前所有試劑室溫平衡30分鐘；用CBS(碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L，pH為9.6)稀釋包被原BAL-BSA(1∶5000)，以100 μL/孔包被到96孔板，37℃孵育2小時(shí)，用PBST洗板4次后，再用脫脂奶粉(5 g溶于100 mL去離子水中)250 μL/孔封閉。放入4℃冰箱過(guò)夜，PBST洗版3次，備用。

向包被好的96孔微孔板中加入待測(cè)樣品或黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL/孔，空白孔加入等量空白腦脊液，放入37℃溫箱孵育1小時(shí)，取出后PBST洗板3次；以黃芩苷對(duì)照品質(zhì)量濃度為0的測(cè)定孔為陽(yáng)性對(duì)照孔，加入以PBS按照1∶10000稀釋的酶標(biāo)二抗，每孔100 μL，于37℃溫箱孵育30分鐘；取出后用PBST洗板3次，每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃溫箱顯色15分鐘；以2 mol/L硫酸溶液50 μL/孔終止反應(yīng)。將整塊微孔板置于酶標(biāo)儀，測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度A值。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 線性關(guān)系 取以上配制的濃度范圍從3.2～2000 ng/mL系列黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上icELISA檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，以A/A0(A0為空白孔OD值，A為檢測(cè)孔OD值)為y軸，黃芩苷濃度的自然對(duì)數(shù)為x軸，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算線性范圍。

1.6.2 精密度 取以上標(biāo)準(zhǔn)溶液中400 ng/mL、80 ng/mL和3.2 ng/mL 3個(gè)濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照以上的icELISA檢測(cè)步驟進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔，每條標(biāo)曲用1塊板測(cè)定，得出板間精密度。

1.6.3 回收率 在空白大鼠腦脊液中定量加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為400 μg/mL、80 μg/mL和3.2 μg/mL的黃芩苷腦脊液溶液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔檢測(cè)?；厥章视?jì)算公式如下：回收率=(黃芩苷檢測(cè)濃度/黃芩苷加入濃度)×100%。

1.6.4 樣品檢測(cè) 取腦脊液室溫溶解，置高速離心機(jī)內(nèi)10000 rpm，離心4分鐘，溫度4℃，取上清液，加入包被好的96孔板，按以上檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

以A/A0(A0為空白孔OD值，A為檢測(cè)孔OD值)為Y軸，黃芩苷濃度的自然對(duì)數(shù)為X軸，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，線性擬合回歸方程為：y=0.1069ln(x)+1.0144，R2=0.9885。見圖1。

圖1 黃芩苷在腦脊液中的線性關(guān)系

2.2 精密度

通過(guò)檢測(cè)，得出精密度見表1。從表1可以看出，小鼠腦脊液中高、中、低3種濃度黃芩苷含量檢測(cè)的精密度分別為13.14%、6.65%、6.04%，數(shù)據(jù)均≤15%，能夠滿足檢測(cè)需求。

表1 icELISA法測(cè)定不同濃度黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度

2.3 回收率

按照回收率計(jì)算公式：回收率=(黃芩苷檢測(cè)濃度/黃芩苷加入濃度)×100%,測(cè)得結(jié)果見表2。從表2可以看出，檢測(cè)高、中、低3個(gè)濃度血漿溶液中黃芩苷的回收率分別為91.35%、87.04%和117.67%(SD≤15%)，均在±20%之內(nèi)，可以滿足生物樣品的檢測(cè)要求。

表2 icELISA法測(cè)定不同濃度黃芩苷血漿溶液中標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率

2.4 樣品檢測(cè)

從給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)腦脊液中黃芩苷的平均含量可以看出，在給藥2小后黃芩苷在大鼠腦脊液中含量達(dá)到峰值，隨后下降，且下降速度較快，在給藥4小時(shí)后腦脊液中黃芩苷含量最低。見表3。

表3 黃芩苷在腦脊液中的藥物分布經(jīng)時(shí)表

3 討論

黃連解毒湯在治療多種腦部疾病方面有著切實(shí)的臨床療效，其中黃芩苷(7-O-β-D葡萄糖醛酸)作為黃芩的主要有效成分發(fā)揮著重要作用。目前黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)研究的主要檢測(cè)手段是高效液相色譜法和質(zhì)譜法等，但是由于這些方法的樣品需要純化等前處理步驟，對(duì)采樣量需求較大，難以完成中藥復(fù)方在腦脊液中的含量檢測(cè)，這也是一直未見報(bào)道黃連解毒湯主要成分黃芩苷在腦積液中分布的原因。本實(shí)驗(yàn)從每只大鼠中每次只能獲得100 μL左右的腦脊液，樣品離心后就可以直接用于檢測(cè)，不需要進(jìn)行除蛋白等前處理程序，所以才具有了開展此項(xiàng)研究的可能性。

本實(shí)驗(yàn)室前期自制了黃芩苷單克隆抗體，并對(duì)抗體的特異性等進(jìn)行了檢測(cè)，如果將制備的黃芩苷單抗對(duì)黃芩苷的交叉反應(yīng)率定為100%，結(jié)果與黃連解毒湯中含有的主要成分梔子苷、葛根素、大豆苷等的交叉反應(yīng)率均<0.10%，表明此抗體的特異性良好[14]。而且，黃芩苷在胃腸道幾乎不被吸收，需要轉(zhuǎn)化成黃芩素吸收入血，但是在進(jìn)入血液后又被還原成黃芩苷，故在血液和組織中檢測(cè)到的仍然是黃芩苷[15]。另外，本實(shí)驗(yàn)室基于黃芩苷單克隆抗體建立的ELISA檢測(cè)方法，與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致，詳見蘇歆等在《藥物分析雜志》的報(bào)道[16]。

鑒于中藥復(fù)方成分的復(fù)雜性和樣品含量相對(duì)較低的特點(diǎn)，其組織分布研究一般是取給藥后某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組織進(jìn)行檢測(cè)。雖然像HPLC-MS/MS這種高端儀器設(shè)備已經(jīng)普遍應(yīng)用于中藥藥代和組織分布的研究，但是其對(duì)樣品的制備較為嚴(yán)格和繁瑣，限制了其開展廣泛的研究。icELISA法具有特異性高、樣品處理簡(jiǎn)單、樣品用量少(50 μL就可以滿足檢測(cè)量的需求)、靈敏度高(與液質(zhì)聯(lián)用的靈敏度相當(dāng))、檢測(cè)時(shí)間快、樣品處理量大、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)，非常適合中藥復(fù)方的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究。本實(shí)驗(yàn)在以往黃芩苷藥代動(dòng)力學(xué)的研究基礎(chǔ)上，對(duì)采樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)了給藥后1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)和4小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，既能反應(yīng)黃芩苷在腦部分布的經(jīng)時(shí)特征，又沒有犧牲大量動(dòng)物。

在臨床實(shí)踐中，有時(shí)用腦脊液藥物濃度水平作為藥物腦組織穿透力的證據(jù)，甚至有時(shí)用腦脊液藥物濃度代替感染部位的藥物濃度預(yù)測(cè)療效[17]。但腦脊液的提取具有一定難度，所以研究相對(duì)較少。大量研究表明,黃芩苷對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[17]，但黃芩苷是否可以透過(guò)血腦屏障到達(dá)作用的靶部位，至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用icELISA檢測(cè)法首次從腦脊液中檢測(cè)到了黃芩苷，對(duì)黃芩苷能夠透過(guò)血腦屏障提供了直接的證據(jù)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，作者證明了黃芩苷可以通過(guò)血腦屏障。結(jié)合現(xiàn)有研究認(rèn)為黃芩苷對(duì)缺血性腦中風(fēng)的保護(hù)作用可能與抗氧化、抗炎、抗興奮性毒性和促進(jìn)神經(jīng)再生作用有關(guān)[18]。因此，本研究為黃連解毒湯治療中風(fēng)等疾病的臨床應(yīng)用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為日后治療腦病疾病合理用藥提供了依據(jù)。