陽和平喘顆粒通過TGF-β1/Smad信號通路影響慢性哮喘大鼠氣道重塑的機制

徐晴雯，任馮春，李 敏，朱慧志，劉向國，劉 璐

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

哮喘是一種涉及多種炎癥細胞，以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]，其主要病理特點是氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應[2]。氣道重塑是長期慢性炎癥引起的氣道結構的改變，其特征是上皮下纖維化、氣道壁增厚、平滑肌質(zhì)量增加、新生血管生成和黏液腺增多[3]。轉化生長因子β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)/Smad信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與氣道重塑相關的重要機制之一[4-5]。本研究通過復制哮喘大鼠模型，觀察陽和平喘顆粒對哮喘氣道炎癥及氣道重塑的影響并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物與分組 SPF級SD大鼠50只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物管理中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2011-0003]，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心。適應性喂養(yǎng)1周后采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、地塞米松組、陽和平喘顆粒低劑量組、陽和平喘顆粒高劑量組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)(批號A5253)：美國Sigma公司；陽和平喘顆粒(藥物組成為麻黃、五味子、葶藶子、巴戟天、熟地黃、白芥子、旋覆花、當歸等，每包10 g，每克含生藥量2.7 g；批號 20120511)：安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心；醋酸地塞米松片(每片0.75 mg；批號 111110)：浙江仙琚制藥股份有限公司；白細胞介素4(interleukin 4, IL-4)ELISA試劑盒(批號E-30645)、白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒(批號E-30644)：上海源葉生物科技有限公司；兔抗Smad2(批號B58028)、兔抗Smad3(批號B58031)、兔抗TGF-β1(批號G58011)：安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.3 儀器 魚躍503AI型超聲霧化器：江蘇魚躍集團；霧化箱(130 cm×80 cm×75 cm)：自制；BX-Ⅸ型生物組織包埋機：孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；EPS-300 型電泳儀：上海天能科技有限公司； BX51型光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；DM4000B型圖像采集系統(tǒng)：德國Leeia公司。

2 方法

2.1 動物模型復制 根據(jù)劉中成等[6]的方法并加以改進復制大鼠慢性哮喘模型。致敏：模型組、地塞米松組、陽和平喘顆粒低劑量組和陽和平喘顆粒高劑量組在實驗的第1天和第8天分多點腹腔注射致敏液(OVA 1 mg +氫氧化鋁凝膠100 mg +生理鹽水1 mL)；正常組注射等量生理鹽水。激發(fā)：實驗第15天開始將大鼠放入霧化箱中，予以1% OVA溶液霧化，每周3次，每次30 min，連續(xù)6周；正常組予以等量生理鹽水。大鼠出現(xiàn)喘息、噴嚏、呼吸急促、煩躁不安、站立不穩(wěn)等癥狀則為激發(fā)成功。

2.2 藥物干預 將陽和平喘顆粒加生理鹽水溶解配制成0.175 g/mL和0.7 g/mL的混懸液，將醋酸地塞米松片碾碎后加生理鹽水配制成0.008 75 mg/mL的混懸液。根據(jù)體表面積法進行折算，于實驗第15天開始，陽和平喘顆粒低劑量組和陽和平喘顆粒高劑量組每日分別予以陽和平喘顆粒1.75、7 g/kg灌胃，其用藥量分別相當于臨床用量的3.5倍和14倍；地塞米松組每日予以地塞米松0.087 5 mg/kg灌胃，其用藥量相當于臨床用量的7倍。正常組和模型組每日分別給予生理鹽水10 mL/kg灌胃。各組均持續(xù)灌胃6周。

2.3 指標檢測

2.3.1 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察支氣管肺組織形態(tài)學改變 采用HE染色，在顯微鏡下觀察分析各組大鼠支氣管肺組織的病理改變。

2.3.2 ELISA法檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IL-4和IL-6的水平 取各組大鼠BALF，離心取上清，參照ELISA試劑盒說明書的步驟，檢測BALF中IL-4和IL-6的水平。

2.3.3 Western blot法檢測支氣管肺組織中TGF-β1、Smad2與Smad3蛋白表達 提取大鼠左肺組織蛋白，按照試劑盒要求，按步驟完成上樣，電泳，轉膜，封閉抗體，孵育一抗、二抗，徹底洗滌后經(jīng)增敏化學發(fā)光法顯色，加入底物與反應液后，顯色5 min。用IPP軟件對圖像目的條帶進行灰度分析，以與內(nèi)參照β-actin產(chǎn)物條帶的比值作為相對表達水平。

3 結果

3.1 各組大鼠支氣管肺組織形態(tài)學改變 鏡下可見正常組大鼠支氣管肺組織結構清晰完整，無炎癥細胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠支氣管管腔變窄，平滑肌層及基底膜層增厚，周圍可見炎癥細胞浸潤；與模型組比較，陽和平喘顆粒低劑量組、陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組大鼠支氣管管腔接近正常，平滑肌層及基底膜層增厚減輕，炎癥細胞浸潤較少；與陽和平喘顆粒低劑量組比較，陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組改善更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠支氣管肺組織病理學改變(HE染色，10×20倍)

3.2 各組大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比較 與正常組比較，模型組BALF中IL-4和IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4和IL-6水平均顯著降低(P<0.05)；陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4和IL-6水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BALF中IL-4和IL-6水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與陽和平喘顆粒低劑量組比較，◇P<0.05

3.3 各組大鼠支氣管肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對表達水平比較 與正常組比較，模型組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對表達水平明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，陽和平喘顆粒低劑量組、陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05)；與陽和平喘顆粒低劑量組比較，陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組肺組織中TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖2、表2。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽和平喘顆粒低劑量組；D.陽和平喘顆粒高劑量組；E.地塞米松組

圖2 Western blot法檢測各組大鼠肺組織中TGF-β1、

Smad2、Smad3蛋白相對表達水平

4 討論

中醫(yī)將哮喘歸為“哮病”范疇，認為該病多因痰飲留伏，結成窠臼，潛伏于內(nèi)，復感外邪，引動內(nèi)痰，痰阻于肺，肺失宣肅，故上氣而喘，痰鳴如吼，發(fā)為哮病。哮病日久，肺脾腎三臟皆損。該病病性屬本虛標實，故治療多以補腎、化痰、活血調(diào)營為主。陽和平喘顆粒是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院研發(fā)的院內(nèi)制劑，系胡翹武臨床經(jīng)驗方[7]，由《椿田醫(yī)話》陽和飲化裁而來，臨床已有數(shù)十年應用歷史。全方組成為麻黃、五味子、葶藶子、巴戟天、熟地黃、白芥子、旋覆花、當歸等藥。方中以麻黃宣肺平喘，利水消腫；五味子、巴戟天、熟地黃溫補腎陽，納氣平喘；旋覆花、白芥子、葶藶子溫肺化飲、利氣消痰；當歸養(yǎng)血活血，祛瘀平喘。諸藥合用，共同達到溫腎宣肺、化痰降氣、活血調(diào)營的功效。前期臨床研究[8]表明，陽和平喘顆?？梢愿纳品喂δ?，減輕氣道炎癥，進而緩解患者的臨床癥狀。前期動物研究[9-10]表明，陽和平喘顆粒可以降低炎癥因子表達水平，抑制杯狀細胞增生，減輕氣道黏液高分泌，從而減輕氣道炎癥及延緩氣管重構，對哮喘大鼠有確切的治療作用。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與地塞米松組比較，△P<0.05；與陽和平喘顆粒低劑量組比較，◇P<0.05

現(xiàn)代醫(yī)學認為，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的原因，Th2細胞因子在哮喘發(fā)病中起著重要作用[11]。Th2亞群主要分泌IL-4、IL-6、IL-13等細胞因子，IL-4激活B細胞促進分泌產(chǎn)生IgE[12]。而IL-6作為重要炎癥遞質(zhì),對急性蛋白及免疫球蛋白E生成有促進作用[13]。另有研究證實，IL-4作為炎性細胞因子可以與TGF-β共同作用[14]，誘導成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞分泌大量細胞外基質(zhì)并沉積[15]。IL-6可誘導TGF-β信號傳導[16]，刺激肌纖維母細胞增殖后促進上皮下纖維化的形成，增加氣道上皮下膠原蛋白沉積和基底膜厚度[17]。

TGF-β1/Smad信號通路參與氣道重塑過程，TGF-β1表達與氣道基底膜厚度、成纖維細胞數(shù)目呈正相關，與哮喘發(fā)作的嚴重程度也有正相關性[18]。研究表明，哮喘大鼠肺組織中TGF-β1水平升高[19]。Smad蛋白作為TGF-β信號轉導系統(tǒng)的重要成員，直接從細胞膜向細胞核傳遞信號，介導細胞內(nèi)TGF-β信號轉導，調(diào)控細胞增殖、轉化、合成、分泌和凋亡[20]。其中Smad2、Smad3為受體調(diào)節(jié)型蛋白，直接參與信號轉導，起正調(diào)節(jié)作用，促進纖維母細胞向纖維細胞轉化，促進氣道肌成纖維細胞增殖。Smad2、Smad3磷酸化后刺激TGF-β1產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白，并且TGF-β1使成纖維細胞分化成肌成纖維細胞[21]。肌成纖維細胞增殖，膠原沉積增多，氣道壁增厚，黏液腺增多等改變最終使傷痕組織取代了正常的肺組織，使氣體交換面積減少，最終導致呼吸能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠支氣管肺組織病理改變明顯，氣管壁及周圍炎癥細胞浸潤程度增加，BALF中IL-4、IL-6水平均明顯升高，提示模型組大鼠存在慢性炎癥，模型復制成功；而與模型組比較，各治療組大鼠支氣管肺組織病理改變減輕。陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組BALF中IL-4、IL-6水平較陽和平喘顆粒低劑量組下降更明顯，陽和平喘顆粒高劑量組與地塞米松組結果相似。結果提示陽和平喘顆?？梢詼p輕氣道炎癥，與課題組前期研究一致。模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3較正常組明顯增加；各治療組肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3均有所下降，而陽和平喘顆粒高劑量組和地塞米松組較陽和平喘顆粒低劑量組下降更明顯，陽和平喘顆粒高劑量組與地塞米松組結果相似。結果提示陽和平喘顆?？梢詼p輕氣道重塑，這可能與其下調(diào)TGF-β1/Smad信號通路有關。

綜上所述，本研究表明陽和平喘顆?？梢愿纳葡瓪獾乐厮埽瑴p輕氣道炎癥，其機制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路有關。