芪貞降糖顆粒對糖尿病腎病大鼠TGF-β1/Smad信號通路的調控作用

何云嬌，張驪敏，方朝暉，姜 輝，劉曉闖，孫 菁

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥，以高血糖、蛋白尿、水腫等為臨床表現(xiàn)，具有發(fā)病率高、病因機制復雜多樣等特點[1-2]。DN是引發(fā)終末期腎病的主要原因之一，也是導致腎衰竭的重要因素。其主要病理基礎是腎組織間質纖維化增生及腎小球硬化癥。轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是引發(fā)纖維化增生的關鍵因子，Smad蛋白是TGF-β1受體細胞內激酶的作用底物，也是導致腎損害的重要因子[3-4]。芪貞降糖顆粒為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治療糖尿病的特色院內制劑，由黃芪、女貞子、生曬參、黃連、山茱萸、五倍子等組成，臨床應用多年，質量穩(wěn)定，療效明確[5-7]。芪貞降糖顆粒能夠降低糖尿病患者血糖水平，減輕DN血管病變程度，但其具體作用機制尚不清楚。因此，本實驗通過研究芪貞降糖顆粒對TGF-β1/Smad信號通路的調節(jié)作用，探討其改善DN的作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，雄性，清潔級，體質量(200±20)g，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(皖)2011-0002]。

1.2 藥物 芪貞降糖顆粒(黃芪30 g，女貞子、山茱萸各12 g，生曬參9 g，五倍子6 g，黃連5 g)為安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，批號：20180621；二甲雙胍片(每片0.25 g，每盒48片)，上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：67190605。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(批號 SLBB8126V)：美國 Sigma；DAPI染色液、抗熒光淬滅封片液：Beyotime公司；Revert AidTM逆轉錄試劑盒(批號 00691399)：Thermo；PVDF膜(批號 R8CA8257E)：Millipore公司；超敏發(fā)光(enhanced chemiluminescent，ECL)試劑盒(批號 SF249607)：Thermo公司。

1.4 儀器 JW-3021HR型高速冷凍離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；RT-PCR儀：美國Thermo Scientific；微量移液器：德國Eppendorf；RM2016病理切片機：上海徠卡儀器有限公司；ZT-12M自動脫水機、YB-7LF組織包埋機：湖北亞光醫(yī)用電子技術有限公司；全自動生化分析儀：美國Beckman公司；BA410E熒光顯微鏡：中國Motic公司。

2 方法

2.1 動物模型復制 80只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機選取10只為正常對照組，以常規(guī)飼料飼養(yǎng)，其余大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，高脂飼料飼養(yǎng)大鼠按照35 mg/kg腹腔注射STZ(使用前以0.1 mmol/L、pH4.2的檸檬酸緩沖液配制成1% STZ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配)。正常對照組注射等容積的檸檬酸緩沖液。1周后尾靜脈無菌操作后取血，測定大鼠空腹血糖，以血糖值≥16. 7 mmol/L作為模型復制成功的標準[8-9]。

2.2 分組及給藥 將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組，二甲雙胍組，芪貞降糖顆粒低、中、高劑量組，每組10只。其中二甲雙胍組灌胃二甲雙胍180 mg/kg，芪貞降糖顆粒低、中、高劑量組根據前期研究[5]，分別灌胃50、100、200 mg/kg芪貞降糖顆粒，各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)8周，期間各組大鼠自由飲食飲水，模型組和正常對照組分別灌服等量溶媒。

2.3 尿α1微球蛋白，β2微球蛋白和白蛋白含量測定 實驗結束前，將各組大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，經全自動生化分析儀測定尿α1微球蛋白、β2微球蛋白和白蛋白含量。

2.4 腎組織病理形態(tài)學觀察 采用3.5%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，取相同部位的腎皮質，放置在10%的中性甲醛溶液中固定，經乙醇脫水處理，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成3 μm厚切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色后觀察腎組織病理形態(tài)學的變化。

2.5 免疫熒光檢測腎組織TGF-β1和轉化生長因子βⅠ型受體(transforming growth factor beta type Ⅰ receptor，TGF-βRⅠ)的分布表達 取相同部位腎組織， 經切片脫蠟，抗原修復，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌，封閉處理后，滴加一抗孵育1 h，PBS沖洗后滴加熒光二抗避光孵育20 min，甩干，經4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染5 min，加入抗熒光淬滅封片劑封片處理，置于熒光顯微鏡下觀察切片并采集圖像。

2.6 RT-PCR技術檢測腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表達 取各組大鼠腎臟組織50 mg，按照Trizol 法提取腎皮質總RNA，經逆轉錄酶反轉錄合成cDNA。引物由Sangon Biotech公司合成。引物序列見表1。實驗結果以目標基因與β-actin 相對表達量表示。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表達水平 取腎臟組織適量，碾磨破碎處理，提取大鼠腎皮質總蛋白，濕式電轉印至PVDF膜，牛血清白蛋白封閉，TBST洗膜處理，然后分別加入一抗，4 ℃緩慢搖晃，孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，孵育2 h，洗膜后經ECL發(fā)光法進行鑒定，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析定影后條帶吸光度值。以各蛋白條帶與內參β-actin吸光度值之比表示蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1 芪貞降糖顆粒對大鼠尿α1微球蛋白、β2微球蛋白和白蛋白的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠尿α1微球蛋白、β2微球蛋白及白蛋白含量均明顯升高(P<0.05)；給藥8周后，與模型組比較，二甲雙胍組，芪貞降糖顆粒中、高劑量組大鼠尿液α1微球蛋白、β2微球蛋白及尿白蛋白含量均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 芪貞降糖顆粒對大鼠α1微球蛋白、β2微球蛋白和尿白蛋白的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織形態(tài)的影響 HE染色觀察可見，正常對照組大鼠腎小球形態(tài)正常，腎小球基底膜未見明顯異常，腎小管結構完整，排列整齊；模型組大鼠腎小球基底膜厚度明顯增加，腎小球體積變小，腎小管上皮細胞存在空泡化現(xiàn)象。芪貞降糖顆粒組大鼠腎小球形態(tài)基本正常，基底膜存在輕微增生，腎小管排列趨于完整，存在少數(shù)上皮細胞空泡化改變，病變程度較模型組明顯減輕。見圖1。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.芪貞降糖顆粒低劑量組；E.芪貞降糖顆粒中劑量組；F.芪貞降糖顆粒高劑量組

圖1 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織形態(tài)的影響(HE染色，10×20倍)

3.3 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織TGF-β1和TGF-βRⅠ分布的影響 免疫熒光結果顯示：藍色熒光部分為細胞核表達，綠色熒光部分為TGF-β1和TGF-βRⅠ在腎組織的分布與表達。與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1和TGF-βRⅠ分布明顯增多，主要分布在腎小球內；與模型組比較，芪貞降糖顆粒組TGF-β1和TGF-βRⅠ分布明顯降低，表明芪貞降糖顆粒在一定程度上能夠降低TGF-β1和TGF-βRⅠ在腎組織的分布與表達。見圖2、圖3。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.芪貞降糖顆粒低劑量組；E.芪貞降糖顆粒中劑量組；F.芪貞降糖顆粒高劑量組

圖2 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織 TGF-β1熒光表達的影響

注：A.正常對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.芪貞降糖顆粒低劑量組；E.芪貞降糖顆粒中劑量組；F.芪貞降糖顆粒高劑量組

圖3 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織TGF-βRⅠ熒光表達的影響

3.4 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表達水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表達水平明顯增加，Smad7表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，芪貞降糖顆粒組低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表達水平明顯降低，Smad7表達水平明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 芪貞降糖顆粒對大鼠TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和Smad7 mRNA表達水平的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.5 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表達水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和 p-Smad3表達水平明顯增加，Smad7和p-Smad7表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，芪貞降糖顆粒低、中、高劑量組和二甲雙胍組均能不同程度地降低TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3和 p-Smad3表達水平，升高Smad7和p-Smad7的表達水平，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 芪貞降糖顆粒對大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表達水平的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

DN是糖尿病常見的一種微血管并發(fā)癥，具有高血糖、高血壓、高蛋白尿的顯著特征。其具體發(fā)病機制目前仍不完全清楚，一般認為多與遺傳、環(huán)境、炎癥反應、糖脂代謝紊亂以及自身免疫性疾病等有關[10-11]。DN主要病變部位在腎小球，主要表現(xiàn)為基底膜厚度增加和系膜細胞基質進行性積聚，易引發(fā)腎小球硬化癥及終末期腎衰竭病變[12]。芪貞降糖顆粒由黃芪、女貞子、山茱萸、生曬參等組成，組方精煉合理，臨床應用多年，療效確切，常用于治療氣陰兩虛型消渴癥，具有降低血糖、血脂，改善DN等作用，是治療糖尿病及其代謝綜合征的常用藥物。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.芪貞降糖顆粒低劑量組；E.芪貞降糖顆粒中劑量組；F.芪貞降糖顆粒高劑量組

圖4 各組大鼠腎組織TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad7和p-Smad7蛋白表達水平比較

TGF-β1/Smad是引發(fā)DN的主要通路之一，能夠加劇DN癥狀的產生[13-14]。TGF-β1/Smad信號通路由TGF-β1、TGF-βRⅠ及受體底物Smad蛋白家族信號分子構成。TGF-β1是一種內分泌蛋白分子，能夠促進纖維化進程，在腎纖維化和系膜細胞基質積聚方面具有重要作用。正常生理條件下，TGF-β1與TGF-β受體形成受體復合物，從而激活Smad蛋白分子，完成信號通路由細胞質向細胞核的正常傳遞。Smad分為Smad2、Smad3、Smad7 3種形態(tài)。其中Smad2和Smad3是調節(jié)型受體，位于其末端的絲氨酸殘基易被TGF-β1受體激酶產生磷酸化效應而激活，調節(jié)細胞核信號通路傳遞而發(fā)揮轉錄效應[15]。Smad7是Smad家族中的抑制型受體，能夠降低TGF-βRⅠ對Smad3的磷酸化效應，從而阻斷TGF-β1/Smad信號通路的傳遞，減輕腎組織纖維化程度，從而改善DN癥狀。

有研究指出，在DN大鼠腎組織中Smad3表達呈增加趨勢，Smad7表達呈降低現(xiàn)象，經藥物治療后，上述現(xiàn)象存在一定程度的逆轉，表明通過調控TGF-β1/Smad信號通路能夠在一定程度上起到治療DN的作用[16-17]。本實驗結果證實，DN模型大鼠TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表達顯著增加，Smad7表達顯著降低，從而導致DN的發(fā)生。給予芪貞降糖顆粒治療后，TGF-β1、TGF-βRⅠ和Smad3表達明顯降低，Smad7表達明顯升高，該結果表明芪貞降糖顆粒能夠通過改善TGF-β1/Smad信號通路蛋白活性，起到治療DN的作用，其結果與文獻報道一致。

綜上所述，芪貞降糖顆粒能夠減輕DN大鼠腎組織病理損傷程度，改善腎功能，起到減緩DN的作用，其機制可能與調控TGF-β1/Smad信號通路蛋白表達有關。