新藤黃酸抑制人肝癌細胞BEL-7402自噬作用研究

展 凡，王玉涵， 王 萌，鄭 鳳，蘇婧婧，程 卉，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心 新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居腫瘤中第3位[1]。手術切除、肝移植是HCC主要的治療方法[2]，但預后不良導致的HCC患者5年生存率低于5%[3]。越來越多的研究表明，自噬與HCC的危險因素相關，如氧化應激、代謝功能障礙、肝酒精紊亂和脂肪肝疾病[4-5]。細胞自噬是由基因調(diào)控并在進化上保守的細胞內(nèi)降解通路。在自噬過程中，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其可降解細胞質(zhì)中受損、變形的大分子物質(zhì)和細胞器，并將降解產(chǎn)物循環(huán)利用，從而為細胞的正常生存、代謝提供原料[6]。自噬作為抗腫瘤藥物治療的潛在作用靶點近年來已得到確認。但中藥活性成分新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)對人肝癌細胞BEL-7402自噬的影響尚不清楚。本研究通過體外試驗，初步探討GNA抑制人肝癌細胞BEL-7402增殖的作用與自噬的關系。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO公司；潔凈工作臺(SW-CJ1F)：江蘇省蘇凈集團；倒置顯微鏡(Olympus CKX41)和倒置熒光顯微鏡(Olympus BX51)：日本Olympus公司；全自動多功能酶標儀(SpectraMax M2e)：美國MD公司；滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要試劑和藥品 GNA：陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司(純度98%，批號HN045248198)；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；氯喹(Chloroquine ，CQ)(貨號C6628)：Sigma公司；雷帕霉素(Rapamycin ，Rap)(貨號53123-88-9)：Sigma公司；阿霉素(貨號 25316-40-9)：Selleck公司；anti-beclin 1(批號3495T)、anti-LC3B(批號3868T)、anti-p62 (批號8025T)和anti-actin (批號3700T)：美國CST公司。

2 方法

2.1 細胞活力和藥物敏感性檢測 將對數(shù)生長期的細胞按照5×103/mL接種于96孔板。設立空白對照組(0 μmol/L GNA)和不同濃度給藥組，每組設6個復孔。待細胞貼壁良好，棄培養(yǎng)基，每孔分別加入0、2、4、8、16 μmol/L的GNA溶液100 μL，放置37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱24、48、72 h后棄去培養(yǎng)基，在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT培養(yǎng)液20 μL繼續(xù)孵育。孵育終止棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床上避光振蕩10 min后用酶標儀在570 nm波長處測每孔的光密度(optical density，OD)值，按照上述過程，重復3次，計算細胞存活率。

2.2 單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色熒光顯微鏡觀察自噬體的形成 將對數(shù)生長期的細胞以每孔3×105個接種于6孔板，待細胞生長良好，按照實驗要求分為空白對照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組。細胞培養(yǎng)24 h，收集對照組和給藥組細胞，PBS洗2遍，用1 mL PBS重懸，加入1 μL MDC儲存液(濃度為50 mmol/L)，使MDC的終濃度為0.05 mmol/L。37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3遍。吸取微量細胞懸液滴于玻片，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察自噬小體。

2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬體水平 按照試驗要求設立空白對照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組。細胞培養(yǎng)24 h，收集細胞，離心使細胞沉淀成團，將戊二醛沿著管壁緩慢加入用于固定細胞，放入4 ℃冰箱。次日用PBS洗滌細胞3遍，每次5 min；再用鋨酸于4 ℃固定1.5 h，PBS洗3次，每次5 min；按以下步驟脫水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min，100%乙醇10 min，100%丙酮10 min 2次；環(huán)氧樹脂包埋過夜；再放入45 ℃烘箱內(nèi)固化12 h；切片后用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構。

2.4 Western blot法檢測自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、p62、beclin 1的表達情況 將對數(shù)生長期的細胞按照每孔5×106個接種于6孔板，待細胞生長良好，按照試驗要求分為空白對照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組以及CQ組(10 μmol/L)，細胞培養(yǎng)24 h。提取各組總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。蛋白上樣量定為20 μg。進行SDS-PAGE電泳，結束后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，在5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，棄封閉液并洗膜。加入對應的一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，搖床慢搖2 h，洗膜后曝光處理。并計算目標蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度比值，以此來確定各組蛋白的相對表達量。以上實驗重復3次。

3 結果

3.1 GNA對人肝癌細胞BEL-7402存活率的影響 不同濃度的GNA作用于BEL-7402細胞24、48、72 h后，BEL-7402細胞存活率隨時間和劑量依賴性降低，IC50分別為6.408、4.077、3.001 μmol/L。見圖1。

注：與空白對照組比較，*P<0.05

3.2 GNA對人肝癌細胞BEL-7402形態(tài)的影響 空白對照組細胞貼壁生長，細胞數(shù)目較多且排列緊密，胞質(zhì)均勻透明；Rap組細胞貼壁生長較少，細胞脫落、懸浮增加，形狀不一，細胞碎片化；不同濃度GNA組，隨藥物濃度增加，細胞貼壁數(shù)量減少，排列不緊密，細胞懸浮增加，高濃度GNA組出現(xiàn)細胞碎片化。見圖2。

注:A.空白對照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖2 倒置顯微鏡下觀察GNA對人肝癌細胞BEL-7402形態(tài)的影響(10×40倍)

3.3 GNA對人肝癌細胞BEL-7402自噬小體形成的影響 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組熒光強度較弱，自噬小體的數(shù)量較少；自噬誘導劑Rap組自噬小體數(shù)目較多；隨GNA濃度增加，熒光強度增加即自噬小體增多。見圖3。

注:A.空白對照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖3 GNA對人肝癌細胞BEL-7402細胞自噬小體形成的影響(MDC染色，10×40倍)

3.4 GNA對人肝癌細胞BEL-7402自噬小體水平的影響 透射電子顯微鏡觀察細胞自噬小體，空白對照組細胞形態(tài)正常，結構清晰，偶見少量自噬小泡；Rap組細胞漿中出現(xiàn)大量自噬空泡聚集；隨GNA濃度的增加，自噬泡數(shù)目增多，堆積明顯。圖中箭頭所指均為自噬小體。見圖4。

注:A.空白對照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖4 透射電子顯微鏡觀察GNA對人肝癌細胞BEL-7402自噬小體水平的影響(1×20 000倍)

3.5 GNA對人肝癌細胞BEL-7402自噬相關蛋白表達的影響 不同濃度(1.5、3、6 μmol/L)GNA作用細胞24 h后，隨藥物濃度的增加，Beclin1、p62和LC3-Ⅱ蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)，LC3-Ⅰ蛋白水平無明顯變化；Rap組各自噬相關蛋白的表達說明Rap可誘導人肝癌BEL-7402細胞發(fā)生自噬(見圖5Ⅰ)。單獨加入10 μmol/L CQ可降低Beclin1蛋白表達，增加LC3-Ⅱ蛋白表達以及p62蛋白的積累，結果提示GNA對人肝癌BEL-7402細胞自噬的影響可能與其抑制自噬后期進程有關(見圖5Ⅱ)。

注：A.空白對照組；B.Rap組；C.GNA 1.5 μmol/L組；D.GNA 3 μmol/L組；E.GNA 6 μmol/L組；F.10 μmol/L CQ組；與空白對照組比較，*P<0.05

4 討論

近年來，自噬被認為與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關，當腫瘤細胞處于饑餓、化學治療、低氧等應激情況時，腫瘤細胞內(nèi)自噬水平升高，為腫瘤細胞生存提供必須的營養(yǎng)和能量，腫瘤細胞存活能力增強。越來越多的研究表明，中藥有效成分可通過調(diào)控腫瘤細胞自噬水平來抵抗癌癥，增加癌癥治療的可能性[7-8]。

中藥藤黃系藤黃科植物分泌的干燥樹脂[9]，黃棕色，呈不規(guī)則塊狀。1984年呂歸寶從藤黃中分離得到GNA，其具有良好的抗腫瘤作用。近年來，本課題組對GNA的系列研究發(fā)現(xiàn)，GNA能夠抑制多種腫瘤細胞增殖，其抗腫瘤作用與調(diào)控線粒體氧化應激、調(diào)節(jié)細胞周期、誘導細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞保護性自噬有關[10-14]。本研究表明，GNA在一定劑量范圍呈時間和劑量依賴性抑制BEL-7402細胞增殖。GNA處理后，MDC染色熒光顯微鏡觀察和透射電子顯微鏡觀察結果均顯示，細胞內(nèi)自噬小體堆積。同時，Western blot檢測結果表明，自噬上游蛋白Beclin1的表達增加，提示自噬被激活；LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變增加，也提示自噬小體數(shù)量的增多。但是這些證據(jù)并不能特異性反映自噬水平的增加，如果自噬進程后期溶酶體功能受到抑制，也可能導致自噬體堆積，LC3-Ⅱ含量積累。值得一提的是，筆者發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變的同時，LC3-Ⅰ的含量并沒有顯著變化，因此推測，GNA誘導的自噬可能并不是完整過程的自噬。此外，自噬溶酶體降解底物p62的表達增加，p62的總細胞蛋白表達水平與自噬水平呈反相關。因此筆者認為，GNA可能有阻斷BEL-7402細胞自噬后期進程中溶酶體的功能。加入自噬溶酶體抑制劑CQ處理后結果顯示，CQ對LC3和p62蛋白的調(diào)節(jié)作用與GNA一致，進一步證實了GNA可能部分通過抑制自噬促進腫瘤細胞死亡的猜測。但是GNA的這種抑制自噬促進細胞死亡的信號途徑有待于進一步的研究。