冬蟲夏草中砷的形態(tài)分析與評(píng)價(jià)

邵勁松， 胡耀娟， 劉蘇莉， 季正芯， 高麗英， 陳昌云*

(1.南京曉莊學(xué)院環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171;2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇南京 210036)

隨著快速城市化和工業(yè)化的迅猛發(fā)展，大量砷進(jìn)入環(huán)境中[1，2]。根據(jù)2016年中國(guó)農(nóng)業(yè)土壤的調(diào)查顯示，近10%的研究領(lǐng)域相當(dāng)一部分是砷和重金屬污染[3]。土壤中砷濃度過高會(huì)影響作物生長(zhǎng)，最終危害到人類健康和生態(tài)系統(tǒng)安全。冬蟲夏草作為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，補(bǔ)腎益肺，止血化痰等功效[4]。2016年，食藥監(jiān)局叫停冬蟲夏草用于保健品的試點(diǎn)工作，對(duì)部分蟲草及相關(guān)系列產(chǎn)品的檢測(cè)表明，其砷含量可能超出保健食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)限定值，長(zhǎng)時(shí)間食用存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

不同形態(tài)的砷化合物毒性相差甚遠(yuǎn)[5，6]。以無機(jī)砷毒性最大，有機(jī)砷的毒性較弱。目前所知的食藥材中以二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)、砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)等形式存在[7，8]。因此，單以砷總量來衡量整體毒性是不全面的，還應(yīng)考察不同形態(tài)的毒性。針對(duì)砷形態(tài)分析技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)已有成熟的方法[9 - 12]。曹曉剛等[13]建立了高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜(HPLC-HG-AFS)法同時(shí)測(cè)定西藏冬蟲夏草中的四種砷形態(tài)，但該文分析冬蟲夏草時(shí)并未對(duì)片劑、膠囊不同劑型，蟲部、草部不同部位的砷形態(tài)進(jìn)行比較與評(píng)價(jià)。事實(shí)上劑型不同、部位不同，藥效和砷含量也不盡相同，因此，有必要對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)考察與評(píng)價(jià)。

本文采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了系統(tǒng)地優(yōu)化，采用HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)，建立了冬蟲夏草產(chǎn)品中不同砷形態(tài)化合物含量的檢測(cè)方法，并詳細(xì)分析比較了蟲草不同部位以及生藥與不同劑型的熟藥之間的含砷量，為冬蟲夏草的食用安全性評(píng)價(jià)提供了更加可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

SAP 20-SA 20高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用儀(北京吉天儀器有限公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SHA-C水浴恒溫震蕩器(金壇市恒豐儀器制造有限公司)；FD115電熱恒溫干燥箱(BINDER)；AB304-S電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；pHS -3C酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；真空抽濾裝置。

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；砷酸根As(Ⅴ)、亞砷酸根As(Ⅲ)、二甲基砷(DMA)、一甲基砷(MMA)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(以As計(jì)分別為：17.5±0.4 μg/g、75.7±1.2 μg/g、52.9±1.8 μg/g、25.1±0.8 μg/g，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)?？偵楣ぷ鳂?biāo)液配制：將1 mg/L的砷標(biāo)準(zhǔn)液逐漸稀釋濃度為10、20、40、60、80、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。四種砷形態(tài)工作標(biāo)液配制：將5 mg/L四種砷形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐漸稀釋質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。KBH4(分析純，天津市化學(xué)試劑研究所)；(NH4)2HPO4(分析純，西隴化工股份有限公司)；KOH、HNO3(均為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器參數(shù)條件

HPLC-HG-AFS的儀器條件：陰離子交換柱Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm i.d.，10 μm)；流動(dòng)相：15 mmol/L (NH4)2HPO4溶液(pH=6)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積100 μL；還原劑：0.35% KOH+2%KBH4溶液；載流：7%HNO3；負(fù)高壓：310 V；總電流：100 mA；輔電流：50 mA；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量600 mL/min；爐高8 mm；蠕動(dòng)泵速65 r/min。

AFS -930雙道原子熒光光度計(jì)的儀器條件：光電倍增管負(fù)高壓290 V；燈電流60 mA；原子化器溫度200 ℃；爐高8 mm；載氣流速400 mL/min；屏蔽氣流速800 mL/min；進(jìn)樣體積1 mL。

1.3 樣品前處理

稱取樣品0.05 g于50 mL離心管中。加入10 mL 1.2 mol/L HNO3，浸提過夜。70 ℃水浴鍋恒溫2.5 h，每隔半小時(shí)振蕩1 min。冷卻后，以8 000 r/min高速離心15 min，取上層清液0.45 μm濾膜過濾，待測(cè)，按相同方法做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 總砷的前處理

稱取樣品0.05 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL HNO3，2 mL H2O2，將消解罐放入微波密閉消解系統(tǒng)中，設(shè)置微波消解條件于200 ℃消解10 min。待程序結(jié)束，置電熱板160 ℃下加熱2 h，用硫脲-抗壞血酸混合溶液定容至25 mL，混勻，靜置，待測(cè)，按相同方法做空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本文用陰離子交換柱分離各種形態(tài)砷化合物，以(NH4)2HPO4溶液為流動(dòng)相，采用等度的洗脫方式。由于流動(dòng)相濃度和流速的選擇直接影響砷形態(tài)分離效果,最終影響樣品中含量的測(cè)定，本文選取流動(dòng)相濃度15 mmol/L，20 mmol/L，25 mmol/L，流速為0.8 mL/min，1.0 mL/min，1.2 mL/min進(jìn)行比較。四種形態(tài)的分離度和保留時(shí)間見表1。

表1 不同流動(dòng)相濃度、流速下四種砷形態(tài)峰的分離度Rs和保留時(shí)間tR

carrier gas flow:400 mL/min; shielding gas flow:600 mL/min ; negative high pressure:300 V; furnace height:8 mm; peristaltic pump speed:65 r/min.

結(jié)果顯示，流動(dòng)相在15 mmol/L的濃度下，四種砷形態(tài)的分離度最好，且它們的保留時(shí)間隨著濃度的增大而減少。當(dāng)流速越大，形態(tài)砷的分離效果越差，保留時(shí)間越來越短，這不利于形態(tài)砷的分析。綜合考慮選擇流動(dòng)相濃度為15 mmol/L，流速選擇為1 mL/min為最佳色譜條件。

2.2 原子熒光光譜條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合廠家給出的相關(guān)參數(shù)值，本文選取負(fù)高壓在280～320 V，爐高在6～10 mm，蠕動(dòng)泵速在60～80 r/min，各選取5個(gè)值，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳范圍。結(jié)果顯示，四種砷形態(tài)物質(zhì)的峰面積均隨負(fù)高壓的增大而增大；爐高大于8 mm時(shí)，峰面積隨之增大而減??；蠕動(dòng)泵速對(duì)峰面積的影響成曲折狀態(tài)。負(fù)高壓大于等于300 V時(shí)，DMA峰分離度較差；隨著蠕動(dòng)泵速增加，組分的分離度逐漸變小。綜合考慮，選擇負(fù)高壓為290～310 V，爐高為7～9 mm，蠕動(dòng)泵速為65～75 r/min。

2.2.2 響應(yīng)面的優(yōu)化方法根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化負(fù)高壓在290～310 V之間，爐高在7～9 mm，蠕動(dòng)泵速為65～75 r/min之間，試驗(yàn)因素編碼和水平如表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平和編碼

根據(jù)試驗(yàn)因素編碼和水平表安排17組實(shí)驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果，以峰面積和分離度為指標(biāo)建立二次多項(xiàng)式回歸模型[13]，并做該模型的方差分析。對(duì)于峰面積而言，因素A、C對(duì)峰面積的影響極顯著，B2對(duì)峰面積影響顯著，其余對(duì)峰面積的影響不顯著；對(duì)于分離度而言，因素A、C2對(duì)分離度的影響極顯著，A2對(duì)分離度影響顯著，其余對(duì)分離度的影響不顯著，但其中因素B和AB對(duì)分離度的影響稍顯著。為了便于對(duì)模型進(jìn)行分析討論，保留了不顯著項(xiàng)。

2.2.3 峰面積下兩因素的交互作用分析由峰面積和峰分離度之間的二次多項(xiàng)式模型的方程做兩因素間的等高線圖和響應(yīng)面圖，各因素及兩因素間的交互作用可以通過組圖[14]直觀反映出來。圖1(b)和圖2(b)中，峰面積隨負(fù)高壓增加而增加，響應(yīng)曲面圖的陡峭表明負(fù)高壓變化對(duì)峰面積的影響達(dá)極顯著水平；圖1(b)和圖3(b)中，蠕動(dòng)泵速對(duì)峰面積的影響趨勢(shì)不明顯，表明蠕動(dòng)泵速變化對(duì)峰面積的影響不顯著；圖2(b)和圖3(b)中，隨著爐高的增加，峰面積成下降趨勢(shì)，降幅較小，響應(yīng)曲面圖陡峭程度一般，說明爐高變化對(duì)峰面積的影響達(dá)顯著水平[15]。由此確定三種因素變化對(duì)峰面積影響的顯著程度為：負(fù)高壓>爐高>蠕動(dòng)泵速，這與方差分析結(jié)果一致。圖3(a)等高線成橢圓形，說明蠕動(dòng)泵速和爐高的交互作用相對(duì)于與負(fù)高壓之間的交互作用稍強(qiáng)。在爐高為8 mm時(shí)，蠕動(dòng)泵速對(duì)峰面積的影響相對(duì)顯著。圖1(a)和圖2(a)的兩因素交互作用不明顯，可能是負(fù)高壓對(duì)峰面積影響較大，而爐高與蠕動(dòng)泵速對(duì)峰面積影響偏小造成。綜上，本文選擇負(fù)高壓為310 V，爐高為8 mm。

圖1 負(fù)高壓和蠕動(dòng)泵速對(duì)As(Ⅲ)峰面積影響的等高線圖(a)和響應(yīng)面圖(b)Fig.1 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the negative high voltage and peristaltic pump speed on the peak area of As(Ⅲ)

圖2 負(fù)高壓和爐高對(duì)As(Ⅲ)峰面積影響的等高線圖(a)和響應(yīng)面圖(b)Fig.2 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the Negative high pressure and furnace height on the peak area of As(Ⅲ)

圖3 蠕動(dòng)泵速和爐高對(duì)As(Ⅲ)峰面積影響的等高線圖(a)和響應(yīng)面圖(b)Fig.3 Contonr plot (a)and response surface (b)showing the peristaltic pump speed and furnace height on the peak area of As(Ⅲ)

2.2.4 分離度下兩因素的交互作用分析當(dāng)蠕動(dòng)泵速較快、爐高較高時(shí)，隨著負(fù)高壓的增加，分離度變小，而蠕動(dòng)泵速較慢、爐高較低時(shí)，隨著負(fù)高壓的增加，分離度先減小后增大。負(fù)高壓對(duì)分離度的影響較明顯。隨著爐高的增加，分離度先減小后增大。蠕動(dòng)泵速對(duì)分離度的影響不大。爐高和蠕動(dòng)泵速對(duì)分離度的影響均不明顯，說明兩因素對(duì)分離度顯著性差。得出三因素變化對(duì)分離度影響的顯著程度為：負(fù)高壓>蠕動(dòng)泵速>爐高，與方差分析結(jié)果一致。

結(jié)合對(duì)峰面積的分析，綜合選擇負(fù)高壓310 V，爐高8 mm，蠕動(dòng)泵速65 r/min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限在0～100 μg/L的范圍內(nèi)，配制的0、20、40、60、80、100 μg/L四種砷形態(tài)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積S對(duì)濃度c擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)載入基線計(jì)算得出砷形態(tài)的檢出限，具體見表3。

表3 線性關(guān)系與檢出限

2.3.2 回收率和精密度本文對(duì)冬蟲夏草樣品中蟲部進(jìn)行了四種砷形態(tài)的低、中、高三水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6次，冬蟲夏草蟲部樣品回收率和精密度的測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 冬蟲夏草中蟲部的四種砷形態(tài)的回收率和精密度(n=6)

(續(xù)表4)

Arsenic formBackground value(μg)Added(μg)Measured(μg)RSD(%)Recovery(%)0.12000.10611.988.4MMA00.08000.06824.285.30.10000.08983.589.80.12000.11452.495.4As(V)00.08000.06983.887.20.10000.09232.592.30.12000.12071.1100.6

2.3.3 穩(wěn)定性考察實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水浴溫度為90 ℃時(shí)，會(huì)造成As(Ⅲ)迅速降解，因此前處理溫度不宜過高，經(jīng)處理過后的樣品應(yīng)置于4 ℃下保存且不超過48 h，否則容易造成As(Ⅲ)降解，影響測(cè)定結(jié)果。

2.3.4 實(shí)際樣品測(cè)定分別對(duì)蟲部(藥店市售)，草部(藥店市售)，蟲部(青海玉樹)，草部(青海玉樹)，片劑，膠囊樣品進(jìn)行砷的四種形態(tài)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生藥中均只有As(Ⅲ)被檢測(cè)出來且含量較高，DMA，MMA，As(V)均未檢測(cè)出；熟藥中四種砷形態(tài)均未檢出。說明樣品中總砷主要以無機(jī)砷形態(tài)存在。蟲部的砷含量明顯大于草部砷含量，片劑和膠囊則未檢出，檢測(cè)結(jié)果如表5所示。

表5 冬蟲夏草中砷形態(tài)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法來優(yōu)化原子熒光光譜的儀器條件，建立了HPLC-HG -AFS測(cè)定冬蟲夏草中的四種砷形態(tài)的方法。針對(duì)本文研究的冬蟲夏草，生藥樣品均能檢測(cè)出As(Ⅲ)，其砷含量超過《中國(guó)藥典》2015年版對(duì)藥材及其制劑的要求(重金屬As殘留量≤2.0 mg/kg)，熟藥樣品，包括市售的膠囊和片劑均未檢測(cè)出。通過與總砷的比較發(fā)現(xiàn)，樣品中存在四種價(jià)態(tài)以外的砷形態(tài)。