固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法測定人參種植土壤中48種農(nóng)藥殘留

姚蘊(yùn)恒， 吳信子， 白龍律， 田海峰， 任秀麗

(1.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)工學(xué)院，吉林延吉 133002)

人參(Ginseng)作為一種珍貴的中草藥，主產(chǎn)于中國、韓國、日本等東亞國家[1]。由于藥用價(jià)值極高，人們對(duì)其藥理和生物活性進(jìn)行廣泛研究[2]。其成分不僅能夠提高人體免疫能力，而且對(duì)神經(jīng)類疾病、糖尿病、心血管類疾病等有良好的治療和預(yù)防效果[3 - 5]。眾所周知，人參的生長周期一般在5至6年，有的甚至10年。這樣一個(gè)長周期的種植與農(nóng)藥的使用是必不可分的，其中以除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、發(fā)芽抑制劑為主，它們的使用可以保護(hù)人參免受病菌、雜草與害蟲的破壞[6]。然而，不合理的使用農(nóng)藥可能導(dǎo)致部分農(nóng)藥沒有被利用而直接遷移到土壤當(dāng)中。由于農(nóng)藥固有的高毒性和難降解性，在土壤中的殘留長期積累不僅會(huì)對(duì)環(huán)境和公共衛(wèi)生造成巨大威脅，而且不利于重茬種植[7]。其高毒性會(huì)直接干擾人體各重要器官的功能，最終導(dǎo)致呼吸麻痹和死亡[8]。因此，發(fā)展敏捷、可靠的分析方法檢測人參種植土壤中農(nóng)藥殘留是人身健康、環(huán)境安全的重要保障。

土壤是由礦物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)、水、空氣及微生物等多組分構(gòu)成的復(fù)雜體系，因此，如何去除基質(zhì)干擾是當(dāng)前面臨的主要問題。目前，樣品前處理的主要方法有液-液萃取法[9]、索氏提取法[10]、加速溶劑萃取法[11]、固相萃取法(SPE)[12]、QuEChERS法[13，14]。SPE是眾多前處理方法中使用最多的一種，該方法操作簡便、提取率高、溶劑消耗量少且固相萃取柱能夠最大限度的除去基質(zhì)干擾。目前，關(guān)于人參種植土壤中農(nóng)藥殘留分析的報(bào)道較少，且主要以氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)為檢測手段。近年來，隨著農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的快速發(fā)展，氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)憑借抗干擾能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，已經(jīng)成為痕量分析的首選[15，16]。本文采用固相萃取法，結(jié)合GC/MS聯(lián)用技術(shù)，建立了一種人參種植土壤中48種農(nóng)藥殘留的檢測方法。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適合批量樣品檢測，有很強(qiáng)的實(shí)用意義，為人參種植土壤中農(nóng)藥殘留的檢測開辟了新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

TSQ 8000 Evo氣/質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；KQ3200型超聲波振蕩儀(昆山市超聲儀器有限公司)；EVA 50A型多功能樣品濃縮儀(北京普立泰科儀器有限公司)。固相萃取柱：NH2(1 000 mg/6mL)、C18(2 000 mg/12mL)、Florisil(1 000 mg/6mL)、PestiCarb(500 mg/6mL)均購于Agela Technologies(天津(中國))。

48種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所。用正己烷分別將各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，備用。分別準(zhǔn)確吸取適量單標(biāo)儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋定容，制成各農(nóng)藥組分質(zhì)量溶度均為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。乙腈、石油醚、丙酮、二氯甲烷、甲醇、正己烷(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；NaCl(優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。水(色譜純，德國CNW Technologies公司)。

1.2 色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：TG -5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm；美國Thermo Fisher Scientific公司)。進(jìn)樣口溫度為290 ℃。程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min；然后以30 ℃/min升至130 ℃；再以5 ℃/min升至250 ℃；最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣(純度≥99.999%)；恒流模式，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：2 μL；總運(yùn)行時(shí)間為38 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)；轟擊能量：70 eV；接口溫度：220 ℃；離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；碰撞氣：氬氣(純度≥99.999%)；溶劑延遲時(shí)間：5 min；掃描方式：選擇離子監(jiān)測(SIM)模式。Xcalibur工作站軟件用于儀器控制與數(shù)據(jù)處理。48種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子和定性離子見表1。

表1 48種農(nóng)藥的相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間、定量離子和定性離子

(續(xù)表1)

No.PesticideMolecular weightRetention time(min)Quantitative ions(m/z)Qualitative ions(m/z)29Procymidone284.1421.62283285,25530Methidathion302.3321.89145157,30231Butachlor311.8622.45176160,18832Isprothiolane290.4023.01290231,20433p,p'-DDE318.0323.19318316,246,24834Nitrofen284.0923.98283253,202,13935p,p'-DDD320.0424.73235237,199,16536o,p'-DDT354.4924.82235237,165,19937Triazophos313.0125.41161172,25738p,p'-DDT354.4926.05235237,246,16539Trifloxystrobin408.3726.18116131,22240Phenylphosphonothioate323.3127.93157169,18541Bifenthrin422.8728.05181166,16542Fenpropathrin349.1728.26265181,34943Tetradifon356.0528.80227356,15944Permethrin391.2930.86,31.05183184,25545Coumaphos362.7831.18362226,364,33446Flucythrinate451.4632.39,32.63199157,18147Fluvalinate502.9033.50,33.58250252,18748Deltamethrin505.2434.22181172,174

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取人參種植土壤樣品為延邊地區(qū)的某人參種植基地隨機(jī)采取的土壤，取樣品200 g置于均質(zhì)機(jī)中攪拌，干燥，備用。準(zhǔn)確稱取10 g(精確至0.01 g)攪拌混勻的樣品至250 mL離心瓶中，用2 mL水潤濕，加入50 mL乙腈，加入5 g NaCl；旋好蓋子后，室溫下(25 ℃)超聲振蕩20 min，3 500 r/min離心5 min；移取有機(jī)層溶液10 mL至150 mL雞心瓶中，40 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2 mL甲醇-二氯甲烷(體積比為1∶19)溶解殘?jiān)?必要時(shí)可渦旋混合)，所得溶液待凈化。

1.3.2 凈化固相萃取柱用5 mL二氯甲烷活化，將上述提取液過柱，再依次用5 mL、5 mL、5 mL甲醇-二氯甲烷(體積比為1∶19)過柱，所得的洗脫液40 ℃水浴中氮吹至干，向其中加入2 mL正己烷復(fù)溶，并過0.22 μm有機(jī)相濾膜，裝瓶，待測。

1.4 共萃取基質(zhì)的測定

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“1.3”節(jié)步驟提取不含目標(biāo)化合物的“空白”樣品，獲得的提取液為稀釋溶劑，制備成系列質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

通過質(zhì)量測定法來考察使用不同萃取劑最終所得的提取液中共萃取基質(zhì)的含量，萃取劑提取后未凈化的萃取液為初級(jí)萃取液，凈化后的萃取液為最終萃取液。分別將2 mL初級(jí)萃取液和最終萃取液置于10 mL已稱重的離心管中，氮?dú)獯蹈珊笥?0 ℃干燥1 h，冷卻后至恒重，與原離心管重量之差即為共萃取基質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

48種農(nóng)藥的分子極性相對(duì)較弱，因此選擇極性較小的TG -5MS石英毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離。首先進(jìn)行全掃描以獲得48種農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖；再根據(jù)質(zhì)譜圖選擇質(zhì)荷比較大、強(qiáng)度較高的特征離子作為監(jiān)測離子。經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，確定48種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量離子和定性離子(表1)。在上述優(yōu)化條件下，48種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/kg)的總離子流色譜圖見圖1，可以看出48種農(nóng)藥的色譜峰形好且被較好分離。

圖1 48種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/kg)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of a mixed standard solution of the 48 pesticides(50 μg/kg)

圖2 采用乙腈、乙酸乙酯、丙酮3種萃取劑的初級(jí)萃取液和最終萃取液中共萃取基質(zhì)的含量Fig.2 Amounts of co-extractives in initial and final extract obtained with three extractant：acetonitrile,ethyl acetate and acetone

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇選擇合適的萃取劑可以在提高目標(biāo)物萃取效率的同時(shí)降低基質(zhì)干擾。本研究比較了乙腈、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、丙酮∶石油醚=1∶1(V/V)的提取效果。結(jié)果顯示：當(dāng)石油醚和丙酮∶石油醚=1∶1(V/V)作為萃取劑時(shí)，回收率較低且對(duì)目標(biāo)物離子化抑制較強(qiáng)；而乙腈、乙酸乙酯、丙酮的提取回收率相對(duì)較高。根據(jù)質(zhì)量測定法測定共萃取基質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)提取出的雜質(zhì)質(zhì)量依次為丙酮>乙酸乙酯>乙腈(圖2)，相比之下，乙腈作為萃取劑的共萃取基質(zhì)含量最少，說明基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)最弱。綜合考慮，本研究選擇乙腈作為萃取劑。

2.2.2 固相萃取柱的選擇目前，固相萃取法中常用的固相萃取柱有NH2、C18、Florisil、PestiCarb等。本文考察了NH2、C18、Florisil、PestiCarb固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果如圖3。PestiCarb固相萃取柱去除雜質(zhì)的效果最好，但因?yàn)槠湮侥芰^強(qiáng)而導(dǎo)致部分農(nóng)藥的損失較大；其中，六氯苯、百菌清、五氯苯胺三種農(nóng)藥被完全去除，無法被檢測到，因此不適用于本研究的農(nóng)藥殘留分析。通過比對(duì)過柱后樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)經(jīng)C18和Florisil固相萃取柱處理后，仍存在一些雜質(zhì)峰，說明凈化效果依次為NH2>Florisil>C18。綜合考慮，本文最終選擇NH2固相萃取柱凈化。

圖3 4種固相萃取柱對(duì)土壤中48種農(nóng)藥凈化效果的影響Fig.3 The effect of purification efficiency for 48 pesticides by four solid phase extraction columns in soil

2.2.3 洗脫劑和洗脫體積的選擇本文考察了不同比例的甲醇-二氯甲烷(1∶9、1∶14、1∶19、1∶24,V/V)作為洗脫劑對(duì)48種農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果表明：四種比例洗脫劑的農(nóng)藥回收率相當(dāng)，相比之下甲醇-二氯甲烷(1∶19,V/V)作為洗脫劑時(shí)，平均回收率在70%～120%范圍的農(nóng)藥數(shù)量最多。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)洗脫劑體積(5、10、15、20 mL)進(jìn)行了考察。分別收集各體積的洗脫流出液，將其濃縮、定容后進(jìn)行GC/MS測定，計(jì)算48種農(nóng)藥的回收率。結(jié)果表明，隨著洗脫劑體積的增加，48種農(nóng)藥的回收率逐漸增大，當(dāng)洗脫劑體積為15 mL時(shí)，農(nóng)藥的回收率最高；而繼續(xù)增加洗脫劑用量，農(nóng)藥的平均回收率趨于恒值。因此，最終確定選擇15 mL甲醇-二氯甲烷(1∶19,V/V)洗脫NH2固相萃取柱。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，ME)是指樣品中分析物以外的組分對(duì)分析物分析過程的離子化而產(chǎn)生的抑制與增強(qiáng)作用[17]。基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配工作曲線的斜率/純?nèi)軇┲泄ぷ髑€的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小，反之則基質(zhì)效應(yīng)越大。48種農(nóng)藥目標(biāo)物在采用“1.3”節(jié)前處理方法得到的萃取液中的基質(zhì)效應(yīng)見表2。48種農(nóng)藥化合物中毒死蜱、三唑磷、苯硫磷、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、o，p′-滴滴涕、p，p′-滴滴涕的基質(zhì)效應(yīng)最為明顯。目前，常見的降低基質(zhì)效應(yīng)的方法有：同位素內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲溶液、基質(zhì)凈化法等；相比之下，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液不僅效果較好，而且具有操作簡單、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。因此，本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

表2 48種農(nóng)藥在土壤中的基質(zhì)效應(yīng)

*The number and names of pesticides are identical to those in Table 1.

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限本實(shí)驗(yàn)采用空白土壤樣品的基質(zhì)提取液，配制質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100、250 μg/kg系列基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2”節(jié)的條件進(jìn)樣測定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3。48種農(nóng)藥在各自的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)空白樣品添加濃度計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)(表3)，檢出限和定量限的范圍分別為2.0～6.0 μg/kg和5.0～20.0 μg/kg。

表3 48種農(nóng)藥的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、定量限、線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

(續(xù)表3)

No.*Recovery(RSD)(%,n=6)10 μg/kg20 μg/kg100 μg/kgLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)RegressionequationLinear range(μg/kg)r21299.5(7.8)88.7(4.2)103.7(9.2)2.05.0Y=34 449 518x-333 5355-2500.998913103.3(5.7)117.4(11.2)115.5(9.0)3.010.0Y=21 704 261x-218 42710-2500.997714-96.5(8.3)105.9(14.4)6.020.0Y=21 312 578x-95 41020-2500.99881595.6(4.7)110.9(10.8)97.9(10.0)3.010.0Y=37 669 614x-548 92710-2500.99751693.1(7.6)94.5(2.8)115.7(9.2)3.010.0Y=65 327 422x-36 33910-2500.999117101.0(8.4)91.2(5.2)114.0(8.3)3.010.0Y=31 999 946x-224 09210-2500.99931897.2(3.8)93.1(5.9)109.3(5.8)3.010.0Y=38 447 703x-408 53310-2500.998719102.5(2.7)95.3(4.3)88.0(10.6)2.05.0Y=126 413 945x-1 273 4775-2500.99882094.3(4.6)99.6(5.6)111.4(8.1)2.05.0Y= 28 860 702x-200 3415-2500.999321114.9(11.0)104.9(6.3)95.9(11.3)2.05.0Y=5 166 5857x-42 3925-2500.999122103.0(8.1)102.6(7.7)128.8(13.3)3.010.0Y= 49 880 132x+811 06910-2500.99612396.2(8.1)89.7(3.2)111.1(14.0)3.010.0Y=13 749 227x-75 47810-2500.999024-91.2(11.9)106.5(9.9)6.020.0Y= 55 428 047x-380 21420-2500.996925111.3(5.7)92.9(12.5)112.2(11.8)3.010.0Y=19 890 174x-4707310-2500.997126101.1(4.4)92.9(7.3)115.9(7.9)3.010.0Y=22 792 717x-177 83110-2500.999127107.0(2.3)101.0(3.9)109.3(9.5)2.05.0Y=46 313 434x-544 9805-2500.998328106.4(11.0)96.8(6.3)112.7(8.2)2.05.0Y=58 951 428x-165 8885-2500.99572989.5(8.6)93.3(8.5)109.2(7.2)2.05.0Y=21 670 980x-75 9945-2500.99623099.1(7.0)87.8(4.9)107.0(8.7)3.010.0Y=28 127 943x-337 65610-2500.99843198.2(7.5)93.1(4.8)116.4(9.9)2.05.0Y=51 707 957x-13 0675-2500.99883295.6(7.1)94.2(6.7)107.7(10.4)3.010.0Y=23 385 997x-113 11310-2500.99653398.6(2.3)98.8(8.5)115.6(9.6)2.05.0Y=103 449 277x-245 1205-2500.99693496.5(1.5)93.8(6.3)114.6(6.7)2.05.0Y=37 195 539x-332 6845-2500.99903598.3(5.4)95.0(5.9)99.9(11.5)2.05.0Y=118 995 982x-951 4055-2500.999336114.5(4.8)105.3(4.0)92.4(14.6)2.05.0Y=43 336 437x-474 2975-2500.997337100.7(8.4)89.7(4.2)108.5(11.6)3.010.0Y=26 115 835x-329 32110-2500.99793896.0(4.0)110.8(3.7)102.3(13.8)2.05.0Y=35 093 408x+112 1975-2500.999339105.1(10.3)90.5(4.3)108.2(9.5)2.05.0Y=49 869 480x-279 5225-2500.999240115.2(3.6)110.2(8.8)116.2(11.2)3.010.0Y=38 209 648x-482 87310-2500.998141-89.6(8.9)93.8(10.3)6.020.0Y=190 870 959x-1 148 38420-2500.997242101.2(2.8)94.0(4.8)112.1(12.0)3.010.0Y=39 261 272x-311 55010-2500.99814394.4(4.8)96.9(9.4)109.6(10.0)2.05.0Y=22 702 546x-79 3405-2500.996044105.5(8.4)97.3(10.6)104.6(5.1)3.010.0Y=35 222 601x-219 77310-2500.99704594.7(8.7)93.5(10.0)89.9(13.4)2.05.0Y=7 545 870x-82 9955-2500.996846115.1(9.3)109.1(13.4)113.3(12.3)3.010.0Y=23 615 854x-4 30210-2500.996547113.5(7.3)89.1(13.8)115.6(12.4)3.010.0Y=15 649 248x-4 72610-2500.998248119.7(3.5)103.5(9.6)110.1(12.7)3.010.0Y=5 128 968x+20 33810-2500.9986

*The number and names of pesticides are identical to those in Table 1.

2.4.2 方法的精密度和準(zhǔn)確度本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量，在無農(nóng)藥殘留的人參土壤空白基質(zhì)中添加48種混合農(nóng)藥進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取10.0 g均質(zhì)的人參土壤樣品于100 mL離心管中，分別添加低(10 μg/kg)、中(20 μg/kg)、高(100 μg/kg)3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)品。分別按照“1.2”節(jié)和“1.3”節(jié)所述的步驟進(jìn)行樣品前處理和測定，每個(gè)添加水平重復(fù)6次。由表3可見，48種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在86.3%～128.8%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于20%。

2.5 實(shí)際樣品檢測

為驗(yàn)證方法的可靠性，采用本文建立的分析方法對(duì)延邊地區(qū)內(nèi)5個(gè)人參種植基地隨機(jī)采取的20份土壤樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，農(nóng)藥檢出率為5%；其中，五氯硝基苯檢出1份，含量0.19 mg/kg。其它土壤樣品中均未檢測出本文涉及到的48種農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測定人參種植土壤中48種農(nóng)藥殘留的SPE-GC/MS分析方法。采用優(yōu)化的SPE方法凈化，能夠有效的除去人參土壤中的礦物質(zhì)、有機(jī)質(zhì)等雜質(zhì)干擾。在優(yōu)化的GC/MS條件下，色譜圖中48種農(nóng)藥色譜峰分離度好且基線平穩(wěn)。方法學(xué)驗(yàn)證了該分析方法的各種參數(shù)(加標(biāo)回收率、RSD、LOD、LOQ)均能夠滿足國內(nèi)對(duì)農(nóng)藥殘留檢測中精密度和準(zhǔn)確度的要求。該方法操作簡單、高效、靈敏可靠，為人參種植土壤中多種類農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、例行檢測等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。