QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定咖啡中丙烯酰胺

林 濤， 李茂萱， 鄒艷虹， 趙金化， 范澤劍， 邵金良*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所, 云南昆明 650205；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(昆明), 云南昆明 650205；3.云南省大理市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站， 云南大理 671000)

丙烯酰胺是目前國際上公認的二類致癌物之一[1]，它具有神經(jīng)毒性[2]、遺傳毒性[3]、生殖毒性[4]及各種潛在致癌性[5，6]。研究表明，淀粉類食品在高于120 ℃的溫度下烹調(diào)下會產(chǎn)生丙烯酰胺[7]，因此，在炸薯條、炸土豆片等高溫下油炸食品中常檢出丙烯酰胺[8]，而近年來的相關(guān)研究也主要集中于丙烯酰胺的形成和抑制機理等方面[9，10]。目前，對于咖啡中丙烯酰胺的研究較少，少量文獻報道主要集中于咖啡中丙烯酰胺形成機理[11]、膳食評估等[12]，而咖啡中丙烯酰胺含量的測定方法也較少?？Х戎谐煞謴?fù)雜、干擾物較多，測定過程中的難度較大，目前還沒有成熟可靠、快速準確的方法，現(xiàn)在常見的方法主要包括了酶聯(lián)免疫分析法[13]、液相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]。近年來，隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的廣泛使用，該方法也應(yīng)用于咖啡中丙烯酰胺的測定，其測定結(jié)果靈敏度較高。但是由于前處理過程中通常都需要利用固相萃取柱凈化，其前處理時間較長，耗時費力[16]。

QuEChERS方法是目前常用的樣品前處理方法，而丙烯酰胺因其極性較大，采用常規(guī)QuEChERS方法的提取液中雜質(zhì)較多，不便于后續(xù)的凈化過程。因此，如何尋找簡便快捷且能夠普遍使用的咖啡中丙烯酰胺提取方法，是目前咖啡中丙烯酰胺測定的主要問題。本研究擬在現(xiàn)有的研究方法基礎(chǔ)上，采用改進的QuEChERS方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，以期建立快捷、簡便的咖啡中丙烯酰胺的快速提取和測定方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

API4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；1290超高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；BSA124S電子分析天平(德國，Sartorius公司)。

丙烯酰胺(純度99%，中國百靈威科技有限公司)；丙烯酰胺同位素內(nèi)標(1,2,3-13C3)(純度99%，1 mg/mL，中國百靈威科技有限公司)。乙酸乙酯、乙腈、甲醇(色譜純，德國Merck公司)；K4[Fe(CN)6]、NaCl、NH4Ac(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙酸、甲酸(色譜純，美國Sigma公司)；石墨化炭黑(GCB)吸附劑(45 μm，美國Sigma公司)；硅藻土吸附劑(Chromosorb G -HP)(北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心)。純凈水(杭州娃哈哈公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制用乙腈分別將丙烯酰胺和丙烯酰胺同位素內(nèi)標稀釋為100 μg/mL的標準儲備液，再分別用乙腈稀釋得到1 μg/mL的丙烯酰胺工作溶液和10 μg/mL的丙烯酰胺同位素內(nèi)標工作溶液，于-18 ℃下低溫避光保存。

1.2.2 樣品前處理準確稱取1.00 g經(jīng)干燥粉碎后的咖啡樣品，置于50 mL離心管中，加入同位素內(nèi)標0.1 mL，加入15 mL正己烷，渦旋振蕩5 min后，6 000 r/min下離心2 min，棄上層正己烷溶液，再加入10 mL 0.1 mol/L K4[Fe(CN)6]溶液，渦旋振蕩5 min后，超聲提取10 min，6 000 r/min下離心10 min后，取上層溶液2 mL于另一15 mL離心管中，加入400 mg硅藻土吸附劑，渦旋混勻后加入5 mL乙酸乙酯，再加入50 mg GCB吸附劑，渦旋混勻后，6 000 r/min下離心2 min，上清液氮氣吹干后，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm濾膜過濾后，待分析。

1.2.3 色譜條件CAPCELL CORE PC色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm；日本Shiseido公司)；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液(含1 mmol/L NH4Ac)，流速：0.2 mL/min，采用等度洗脫方式，洗脫比例為A+B=95%+5%；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件采用ESI源，正離子掃描模式，其中氣簾氣流速為20 L/h，霧化氣流速為55 L/h，輔助氣流速為55 L/h，輔助加熱氣溫度為650 ℃，噴霧電壓為5 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究中采用0.1 μg/mL的丙烯酰胺，分別在正、負離子模式下對其進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化，但是丙烯酰胺在負離子模式下響應(yīng)較差，因此，采用正離子模式，并參照文獻報道[17，18]進行離子對及相關(guān)電壓的優(yōu)化，確定丙烯酰胺測定的離子對條件，如表1所示。

表1 丙烯酰胺的監(jiān)測離子及相關(guān)電壓

*Quantitative ion.

2.2 色譜條件的優(yōu)化

丙烯酰胺屬于小分子化合物，含有一個酰胺鍵，極性較大，因此實驗采用了對極性化合物具有特殊保留行為的親水色譜柱，采用乙腈+水=95%+5%等度洗脫，出峰時間在1 min左右，峰形較好，且采用高比例的有機相時也能夠提高質(zhì)譜的離子化效率。優(yōu)化條件下丙烯酰胺色譜圖見圖1。

圖1 丙烯酰胺標準(a)、丙烯酰胺同位素內(nèi)標(b)和咖啡空白基質(zhì)加標(c)色譜圖Fig.1 Chromatograms of acrylamide standard(a),acrylamide isotope internal standard(b) and coffee blank matrix spike(c)

2.3 凈化方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇首先，采用正己烷將脂肪及低極性化合物除去，然后加入K4[Fe(CN)6]利于咖啡中蛋白質(zhì)的鹽析并吸附，且丙烯酰胺易溶于水，利于咖啡中丙烯酰胺的提??；另一方面，溶液中的無機鹽離子還可促進后續(xù)的液-液萃取過程中水相與乙酸乙酯相的分層。

2.3.2 凈化填料的優(yōu)化選擇實驗中首先采用硅藻土吸附劑對提取溶液進行凈化，吸附劑與外界提取溶液接觸后吸收水分子后被其包被和活化，而提取溶液中的低極性化合物和無機鹽離子等被其吸附，再利用乙酸乙酯與吸附劑表面的液-液萃取而將目標化合物萃取，而GCB的加入，能夠進一步的除去咖啡提取溶液中的色素，相對于PSA、C18、NH2和Florisil等吸附材料，GCB能夠較好的吸附色素，并且在后續(xù)的質(zhì)譜分析中能夠減小基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.3 凈化填料使用量的優(yōu)化選擇試驗了分別在100、200、300、400、500和600 mg硅藻土中加入2 mL 提取溶液時，對于丙烯酰胺的回收效果。結(jié)果表明，隨著硅藻土加入量的增加，丙烯酰胺的回收率逐漸增加，當硅藻土加入量達到400 mg時達到最大的回收效果(76.3%)，隨后其回收降低。通過GCB不同加入量對丙烯酰胺回收效果的比較，確定當GCB加入量為50 mg時達到了較好的回收效果(78.5%)。因此，選擇加入400 mg硅藻土和50 mg GCB吸附劑為較優(yōu)的用量。

2.4 線性范圍和檢出限

分別將丙烯酰胺用乙腈稀釋成不同濃度標準溶液，并分別加入固定含量丙烯酰胺同位素內(nèi)標，以丙烯酰胺峰面積與丙烯酰胺同位素內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，對各濃度進行線性回歸分析。結(jié)果表明，丙烯酰胺在0.01～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)較好(r2=0.9996)；同時選取咖啡基質(zhì)加入一定濃度的丙烯酰胺，按照上述的前處理和測定方法，以3倍和10倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的加標濃度得到檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.15 mg/kg。根據(jù)歐盟對于焙烤咖啡中丙烯酰胺的限量要求為0.4 mg/kg，本方法的檢出限和定量限完全能夠滿足該限量要求。

目前，國家標準(GB 5009.204-2014)的第一法中使用了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法在操作過程中將樣品提取液完全或者分取一半進行后續(xù)的凈化過程，得到了較好的測定效果，但是該方法主要是針對常見的熱加工食品中丙烯酰胺的測定。本研究中采用分取少量提取溶液進行后續(xù)測定，取得了較好的凈化效果和檢測靈敏度，且相對于國家標準中的操作步驟，本方法較為簡便可行。

2.5 回收率和精密度

本實驗中，選取鐵皮卡、卡杜拉和卡蒂姆等代表性咖啡樣品，分別以丙烯酰胺的定量限、5倍和10倍定量限作為添加濃度進行回收試驗和精密度測定，每個添加濃度進行6次平行試驗。結(jié)果如表2所示，丙烯酰胺的回收率范圍為73.6%～81.3%，相對標準偏差范圍為4.7%～6.7%。

表2 丙烯酰胺的回收率和相對標準偏差(RSD)(n=6)

2.6 實際樣品的測定

抽取當?shù)爻屑稗r(nóng)貿(mào)市場中的烘焙咖啡和速溶咖啡樣品各10個樣品進行丙烯酰胺測定，測定結(jié)果為：烘焙咖啡中丙烯酰胺含量范圍為0.164～0.226 mg/kg，速溶咖啡中丙烯酰胺含量范圍為0.071～0.326 mg/kg。根據(jù)歐盟對于烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺的限量標準分別為0.40 mg/kg和0.85 mg/kg，此次抽樣的烘焙咖啡和速溶咖啡中的丙烯酰胺含量均未超過標準要求。

3 結(jié)論

本文利用改進的QuEChERS方法，建立了利用親水色譜柱的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定咖啡中丙烯酰胺的方法。方法的回收率、準確度和精密度均滿足咖啡中丙烯酰胺的測定和限量要求。