低氧對(duì)惡性黑素瘤A375細(xì)胞中Nodal及細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

譚自敏 楊成蓮 鐘桂書 曾凡才

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,四川瀘州，646000;2綿陽市第三人民醫(yī)院皮膚科，四川綿陽，621000；3西南醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四川瀘州，646000

眾所周知，惡性黑素瘤是起源于黑素細(xì)胞的腫瘤，好發(fā)于皮膚，因其早期隱匿、病情進(jìn)展快和致死率高等特點(diǎn)，又有人稱其為“皮膚癌中之王”，晚期惡性黑素瘤的有效治療仍是亟待解決的世界難題[1]。Nodal作為調(diào)節(jié)干細(xì)胞多潛能性、維持胚層發(fā)育和建立體軸等胚胎發(fā)育過程的關(guān)鍵因子，備受各個(gè)領(lǐng)域重視[2]。對(duì)比胚胎發(fā)育和癌癥發(fā)生發(fā)展，不難發(fā)現(xiàn)兩者在諸多方面具有相似性[3]。這也為通過靶向抑制Nodal來治療惡性腫瘤的新思路提供了理論基礎(chǔ)。Nodal的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由位于細(xì)胞膜上的II型受體(ActR II)和I型受體(ALKs)介導(dǎo)，此后依次磷酸化胞內(nèi)SMADs并調(diào)控相關(guān)靶基因表達(dá)。SB-431542是I型膜受體ALK5、ALK4和ALK7的有效抑制劑，它通過抑制ALK5/4/7阻斷Nodal信號(hào)進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時(shí)也阻斷Nodal對(duì)自身的正反饋表達(dá)，起到“Nodal抑制劑”的作用。近年來，不斷有研究表明Nodal能誘導(dǎo)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。EMT過程中，細(xì)胞內(nèi)許多分子如E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白的表達(dá)明顯改變。這些明顯變化的EMT標(biāo)志物與細(xì)胞的形態(tài)、黏附力和運(yùn)動(dòng)能力緊密相關(guān)。因此這些分子也常被用于反映惡性腫瘤的遷移及侵襲能力。除此之外，惡性腫瘤的發(fā)展過程和其特有的微環(huán)境也密切相關(guān)。由于惡性黑素瘤體積增大速度快、局部血管生成相對(duì)減少等原因，它區(qū)別于正常組織的微環(huán)境特點(diǎn)之一便是低氧[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過CoCl2體外造模和相關(guān)技術(shù)檢測(cè)手段，旨在研究惡性黑素瘤A375細(xì)胞內(nèi)低氧微環(huán)境對(duì)Nodal和腫瘤遷移及侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。CoCl2·6H2O、 SB-431542購買于Sigma公司(美國)。主要材料包括一抗人抗鼠Nodal抗體(美國Santa Cruz)、人抗鼠Vimentin抗體(美國Santa Cruz)、人抗鼠MMP2抗體(美國Santa Cruz)、人抗兔E-cadherin抗體(美國Santa Cruz)、人抗兔ALK4抗體(英國 Abcam)和人抗鼠ALK7抗體(英國 Abcam)。二抗主要包括HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(美國 Bioworld)和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(美國 Bioworld)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取出前期凍存的惡性黑素瘤A375細(xì)胞，快速復(fù)蘇細(xì)胞后，于培養(yǎng)瓶中加入新鮮配置的含10% FBS的完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶放置于37℃、含5% CO2的恒溫細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。間隔一日更換一次培養(yǎng)液。顯微鏡下觀察細(xì)胞均勻鋪滿瓶壁約80%后，加入0.25%的胰蛋白酶消化并以3000 r/min的速度在4℃下完成離心，視細(xì)胞狀態(tài)以1∶3或1∶2傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)低氧 本課題組前期實(shí)驗(yàn)已找到CoCl2誘導(dǎo)低氧所需的最佳時(shí)間及濃度，并成功構(gòu)建低氧模型[4]。本實(shí)驗(yàn)將采取前期結(jié)論所得，即在孵育時(shí)間為48 h，濃度為150 μmol/L條件下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SB-431542阻斷Nodal信號(hào)通路 A375細(xì)胞培養(yǎng)至第3～8代對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行SB-431542干預(yù)處理。將SB-431542母液用5%的FBS溶液分別稀釋至濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L。將細(xì)胞懸浮后以每孔約5×103個(gè)接種于96孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。分組加入配置好的SB-431542溶液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)在37℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱中24 h、48 h和72 h。采用MTT法探索SB-431542對(duì)細(xì)胞增殖的影響并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的適宜濃度和時(shí)間。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 按實(shí)驗(yàn)步驟分濃度、分時(shí)間進(jìn)行SB-431542阻斷后，在避光條件下于每孔內(nèi)加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。吸除培養(yǎng)液并加入DMSO 150 μL，震蕩10 min以充分溶解晶體。用波長為490 nm的酶聯(lián)儀測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western Blot方法檢測(cè)蛋白水平 將A375細(xì)胞以約5×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)至貼壁后棄培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)按分組分別進(jìn)行干預(yù)(表1)。藥物干預(yù)后分別提取每孔細(xì)胞的總蛋白。利用BCA法計(jì)算細(xì)胞內(nèi)所測(cè)蛋白的濃度。接下來依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫封閉1 h(5%脫脂牛奶)處理。加入目標(biāo)蛋白一抗并于4℃孵育過夜。次日洗膜后用所測(cè)蛋白二抗于25℃下孵育1.5 h。最后利用ECL法顯影,利用Image Lab軟件分析。

表1 實(shí)驗(yàn)分組

2 結(jié)果

2.1 Nodal抑制劑SB-431542抑制惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖 惡性黑素瘤A375細(xì)胞被不同濃度及不同作用時(shí)間的SB-431542孵育后，MTT法檢測(cè)結(jié)果如圖1。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相同時(shí)間下加入的Nodal抑制劑濃度越大，A375細(xì)胞的增殖活性越低。相同濃度下Nodal抑制劑對(duì)細(xì)胞的作用也呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。當(dāng)Nodal抑制劑SB-431542的濃度大于30 μmol/L時(shí)，其對(duì)細(xì)胞的毒性作用顯著增大，細(xì)胞增殖活性顯著降低。許多涉及SB-431542處理的文獻(xiàn)顯示，將其濃度稀釋至10 μmol/L并再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，此時(shí)測(cè)得的增殖活性較低，但毒性作用不顯著。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)Nodal抑制劑選擇此濃度和時(shí)間。

2.2 低氧誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Nodal、ALK4和ALK7蛋白表達(dá) 構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)低氧微環(huán)境模型并加入Nodal抑制劑處理后，分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組惡性黑素瘤A375細(xì)胞內(nèi)Nodal和ALK4/7的濃度。結(jié)果如圖2所示。CoCl2組細(xì)胞內(nèi)Nodal和ALK7蛋白的濃度較空白組增加，而CoCl2+SB-431542組蛋白的表達(dá)較CoCl2組明顯下降。在本研究的A375細(xì)胞株中，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均沒有檢測(cè)到ALK4的存在。

2.3 低氧誘導(dǎo)E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表達(dá) 利用免疫印跡法檢測(cè)與惡性黑色瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如下圖3所示。CoCl2組細(xì)胞內(nèi)MMP2和Vimentin蛋白濃度較空白組增加(P<0.05)。CoCl2+SB-431542組細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度仍高于空白對(duì)照組，但低于CoCl2組。本研究小組多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A375細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白的各組組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(**P<0.01)

2a:A375細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)SB-431542和(或)CoCl2干預(yù)后用western blot檢測(cè)Nodal及其受體ALK4/7的條帶顯示;2b：以β-actin為內(nèi)參，Nodal在各組中的相對(duì)表達(dá)水平;2c：以β-actin為內(nèi)參，ALK7蛋白在各組中的相對(duì)表達(dá)水平。2b、2c與空白對(duì)照組相比，**P<0.01圖2 各處理組Nodal及其受體ALK4/7蛋白的表達(dá)水平

3a:A375細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)SB-431542和(或)CoCl2干預(yù)后用western blot檢測(cè)與遷移及侵襲相關(guān)蛋白的條帶顯示;3b：以β-actin為內(nèi)參，MMP2蛋白在各組中的相對(duì)表達(dá)水平;3c：以β-actin為內(nèi)參，Vimentin蛋白在各組中的相對(duì)表達(dá)水平。3b、3c中與空白對(duì)照組相比，**P<0.01圖3 各處理組MMP2、Vimentin、E-cadherin的表達(dá)水平

3 討論

惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的信號(hào)級(jí)聯(lián)體系錯(cuò)綜復(fù)雜，目前機(jī)制尚不完全清楚。鑒于胚胎發(fā)育過程與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的相似性，惡性腫瘤研究也越來越多地同胚胎發(fā)育聯(lián)系在一起。Nodal通過誘導(dǎo)干細(xì)胞分化、參與原始胚層形成等途徑促進(jìn)胚胎發(fā)育已經(jīng)得到證實(shí)，故此猜測(cè)Nodal也可能是治療惡性腫瘤的潛在靶點(diǎn)[6]。Nodal在個(gè)體胚胎時(shí)期呈現(xiàn)顯著高表達(dá)狀態(tài)，隨著各個(gè)系統(tǒng)逐漸形成和完善，大多數(shù)組織和器官的表達(dá)逐漸減少直至關(guān)閉[7]。根據(jù)國內(nèi)外多項(xiàng)在常氧條件下進(jìn)行的研究結(jié)果表明，Nodal在惡性黑素瘤細(xì)胞中已關(guān)閉的表達(dá)通道再次開啟，并被證實(shí)其表達(dá)程度隨著腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的增加而增加[8]。惡性黑素瘤的分化程度極低，較之其他高分化癌癥，其更容易處于低氧狀態(tài)。因此，在模擬體內(nèi)的低氧微環(huán)境下研究Nodal對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞遷移及侵襲的影響更加準(zhǔn)確客觀。

本實(shí)驗(yàn)小組延續(xù)前期實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建的低氧模型，通過免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nodal及其受體的濃度。遺憾的是，各實(shí)驗(yàn)組通過免疫印跡法沒有檢測(cè)到ALK4蛋白，猜測(cè)可能與細(xì)胞內(nèi)ALK4濃度低有關(guān)。我們后續(xù)將設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)方案探索原因。與既往研究結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)不但同樣發(fā)現(xiàn)Nodal在惡性黑素瘤A375細(xì)胞中呈現(xiàn)再次高表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)也證實(shí)低氧環(huán)境能誘導(dǎo)Nodal進(jìn)一步表達(dá)?；诖送茰y(cè)在人體內(nèi)，由腫瘤細(xì)胞高代謝等原因引起的低氧可能會(huì)增加Nodal的表達(dá)。

為探討Nodal在腫瘤進(jìn)展中可能的機(jī)制，接下來利用免疫印跡法檢測(cè)與惡性腫瘤遷移及侵襲相關(guān)蛋白的濃度。結(jié)果顯示，Nodal抑制劑SB-431542可以部分逆轉(zhuǎn)由低氧引起的胞內(nèi)MMP2的表達(dá)。MMP2是重要的降解IV型膠原蛋白的蛋白水解酶。它不僅可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)的方式破壞腫瘤細(xì)胞外的第一層屏障[10]，同時(shí)也可以促進(jìn)新生血管生成，從而加快腫瘤發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧誘導(dǎo)的Nodal高表達(dá)可能通過增加MMP2蛋白的水平來促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞遷移及侵襲。

除此之外，本實(shí)驗(yàn)小組還檢測(cè)了A375細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白的水平變化。Vimentin蛋白對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持和改變?nèi)Q于其特殊構(gòu)象。當(dāng)Vimentin蛋白上游受刺激而濃度升高時(shí)，由于收縮作用增加，細(xì)胞逐漸向利于運(yùn)動(dòng)的梭形變化，從而加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移[12]。本實(shí)驗(yàn)所得Vimentin蛋白的變化趨勢(shì)與MMP2蛋白檢測(cè)結(jié)果相似。即低氧增加胞內(nèi)Nodal濃度，進(jìn)而可能通過增加細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白的濃度來促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。

E-cadherin是判斷惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的有效指標(biāo)之一，其胞內(nèi)濃度可間接反映細(xì)胞間的黏附能力。當(dāng)胞內(nèi)、胞外刺激導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)受抑制時(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞之間的黏附力隨之減弱，細(xì)胞的癌旁浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力隨之增強(qiáng)[11]。故此，我們推測(cè)低氧誘導(dǎo)下Nodal的促腫瘤機(jī)制也與E-cadherin有關(guān)。但在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，低氧及Nodal抑制劑對(duì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達(dá)差異并不顯著。究其原因，一可能是A375細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白的表達(dá)主要受其他途徑調(diào)控；二可能是惡性黑素瘤的分化程度低，其在A375細(xì)胞內(nèi)的濃度不高，上游的表達(dá)變化并不足以引起顯著改變。

綜上所述，低氧誘導(dǎo)Nodal高表達(dá)可能通過上調(diào)MMP2和Vimentin蛋白水平，從而促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。我們下一步將繼續(xù)進(jìn)行劃痕試驗(yàn)和基因水平驗(yàn)證低氧誘導(dǎo)Nodal高表達(dá)對(duì)A375細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。本實(shí)驗(yàn)通過模擬低氧微環(huán)境，初步探索了Nodal在惡性黑素瘤的遷移及侵襲過程中可能的作用途徑，在探索腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物以及腫瘤治療靶點(diǎn)有一定的意義。