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    豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中生物胺的生成規(guī)律

    2020-06-06 08:17:56李東蕊劉紅霞吳劍榮夏小樂
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年9期
    關(guān)鍵詞:腐胺精胺制曲

    李東蕊,劉紅霞,吳劍榮,夏小樂*

    1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫, 214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

    豆瓣醬是一種中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品,發(fā)酵過程經(jīng)歷多個(gè)階段,期間多種微生物參與發(fā)酵反應(yīng)[1-2]。豆瓣醬中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有補(bǔ)中益氣,開胃健脾等功效。然而,目前工業(yè)規(guī)模豆瓣醬生產(chǎn)依舊是相對(duì)開放的發(fā)酵體系,環(huán)境因素容易對(duì)豆瓣醬產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響,其中微生物代謝會(huì)造成有害物質(zhì)的積累[3],如產(chǎn)生生物胺、黃曲霉毒素等。

    生物胺是一類具有生物活性且含氮的低分子量的有機(jī)化合物,主要通過微生物氨基酸脫羧作用產(chǎn)生[4-5]。生物胺具有促進(jìn)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,加速生物體的生長(zhǎng)發(fā)育等作用,然而過量攝入可能會(huì)引發(fā)頭痛、中毒等健康問題,嚴(yán)重的甚至危及生命[6-7]。生物胺廣泛存在于幾乎所有的發(fā)酵食品中[8],如發(fā)酵豆制品[9-10]、酒精飲料[11]、乳制品[12]等。它的生成受多種因素影響,如含水量、溫度、pH等,主要是通過影響產(chǎn)胺微生物或者氨基酸脫羧酶的活性來實(shí)現(xiàn)[13-14]。曾雪晴等[15]對(duì)不同種類豆瓣醬中生物胺含量與理化指標(biāo)之間進(jìn)行了分析,然而目前仍缺乏對(duì)豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中生物胺生成規(guī)律及其與品質(zhì)指標(biāo)之間關(guān)系的研究。

    本研究主要探究豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中生物胺的生成規(guī)律,同時(shí)對(duì)生物胺與理化指標(biāo)(含水量、pH、總酸、氨基態(tài)氮及鹽度)及氨基酸之間的相互作用和關(guān)系進(jìn)行了研究和分析,在此基礎(chǔ)上,對(duì)控制豆瓣醬中生物胺含量及提高豆瓣醬品質(zhì)進(jìn)行初步探討。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    發(fā)酵中的豆瓣醬樣品,四川某豆瓣醬廠。豆瓣醬生產(chǎn)及取樣點(diǎn)如圖1所示,每個(gè)批次取8個(gè)樣品,分別對(duì)應(yīng)于0、2、5、8、14、20、26、32 d。

    1-0 d;2-2 d;3-5 d;4-8 d;5-14 d;6-20 d;7-26 d;8-32 d圖1 豆瓣醬發(fā)酵過程和取樣點(diǎn)Fig.1 Fermentation and sampling processes of broadbean paste

    標(biāo)準(zhǔn)品: 組胺、色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺、亞精胺、1,7-二氨基庚烷,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;丹磺酰氯,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;乙腈(HPLC級(jí))、丙酮、HCl、 NaOH、甲醛、AgNO3、鉻酸鉀等,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    HITACHI chromaster高效液相色譜儀,日本日立公司;超聲波清洗儀(SB-4200DT),寧波新芝生物科技股份有限公司;電熱恒溫水槽(DK-8D),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電子天平(AS220.R2),波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne公司;pH計(jì)(FE28),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)(TG 1850-WS),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    參照GB 5009.208—2016[16],將樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液,分別為1、2.5、5、10、15、25、50 mg/L。

    1.2.2 樣品的前處理及生物胺檢測(cè)方法

    樣品的前處理方法參照文獻(xiàn)[17]。標(biāo)品及處理后的樣品按以下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析:

    色譜柱為Diamonsil plus C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),柱溫30 ℃,流速0.80 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相A為乙腈, B為超純水,洗脫程序見表1。

    表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

    1.2.3 豆瓣醬中理化指標(biāo)及氨基酸的檢測(cè)

    含水量的檢測(cè)參照GB 5009.3—2016[18],pH的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[19],氨基酸態(tài)氮、總酸的測(cè)定參照GB 5009.235—2016[20],食鹽的檢測(cè)參照GB/T 5009.40—2003[21],氨基酸含量的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[22]。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用Origin 2016 軟件進(jìn)行繪圖;使用SPSS 19.0 軟件對(duì)生物胺與理化指標(biāo)(含水量、pH、總酸、氨基酸態(tài)氮和鹽度)和氨基酸進(jìn)行相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 豆瓣醬發(fā)酵過程中生物胺含量變化

    2.1.1 生物胺檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取生物胺標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)樣分析,以峰面積比為縱坐標(biāo),生物胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),得到8種生物胺的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2,見表2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,8種生物胺的出峰時(shí)間表明此方法具有較好的分離效果。標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度在1~50 mg/L線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999,表明8種生物胺質(zhì)量濃度與峰面積之間均存在良好的線性關(guān)系。

    表2 生物胺的出峰時(shí)間、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Retention time, regression equations andcorrelation coefficients of biogenic amines

    2.1.2 豆瓣醬發(fā)酵過程中生物胺含量的變化規(guī)律

    豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵主要有制曲、甜瓣子發(fā)酵及混合椒胚曬醬3個(gè)階段。本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)椒胚、曬醬中及曬醬結(jié)束階段的生物胺含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),生物胺含量在曬醬過程基本沒有變化,所以研究重點(diǎn)集中在豆瓣醬發(fā)酵過程中的制曲階段和甜瓣子發(fā)酵階段。

    從圖2可以看出,在豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中,主要的生物胺是腐胺、亞精胺與精胺。總生物胺含量在制曲階段上升后,隨著加鹽溶液發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低。色胺只在豆瓣醬發(fā)酵第8天被檢測(cè)到,且含量較低。腐胺在第0天為50.67 mg/kg;制曲結(jié)束后,迅速升至最大值134.96 mg/kg;在第5天驟降,這是由于添加了鹽溶液起到了一定的稀釋作用,同時(shí)部分腐胺可能轉(zhuǎn)化為亞精胺,隨著發(fā)酵的進(jìn)行腐胺逐漸降低至26.42 mg/kg。而亞精胺與精胺則在第0天存在,制曲結(jié)束后降低至5 mg/kg以內(nèi),可能由于在制曲階段轉(zhuǎn)為腐胺的原因。在加鹽溶液進(jìn)行發(fā)酵后,亞精胺與精胺逐漸增加至20 mg/kg左右,含量變化不明顯,可能由于腐胺在一定條件下作為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為亞精胺和精胺,這與上述所說腐胺含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行而逐漸降低結(jié)果相符合。

    圖2 豆瓣醬發(fā)酵過程中生物胺的含量變化Fig.2 Changes of biogenic amine content during the fermentation of broad bean paste

    2.2 豆瓣醬發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化及其與生物胺相關(guān)性分析

    對(duì)豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示。豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中含水量在17.7%~ 43.97%之間變化,在制曲結(jié)束時(shí),含水量急劇下降至17.7%,而在加鹽水進(jìn)行發(fā)酵后,含水量又上升至40%以上。氨基態(tài)氮含量在整個(gè)發(fā)酵階段基本上呈逐漸上升趨勢(shì),發(fā)酵結(jié)束達(dá)0.631 g/100 g??偹嵩诎l(fā)酵過程中也呈逐漸上升趨勢(shì),但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)略微下降。而鹽度在發(fā)酵過程中變化不大,在9.2~9.52 g/100 g之間。pH在發(fā)酵過程由5.45逐漸下降至4.98,說明豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程整體呈輕微酸性,符合微生物生成生物胺的pH條件[23]。

    a-含水量;b-氨基態(tài)氮、總酸;c-鹽含量、pH圖3 豆瓣醬發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of physicochemical indexes during the fermentation of broad bean paste

    對(duì)豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程生物胺含量和理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(person),如表3所示。雙變量分析結(jié)果表明,腐胺則與含水量、pH、鹽度具有很大的相關(guān)性。而亞精胺與含水量、氨基態(tài)氮、總酸及鹽度均顯著相關(guān)。總生物胺含量與含水量、pH、氨基態(tài)氮、總酸及鹽度顯著相關(guān)。在低pH條件下,微生物為了抵抗酸脅迫,易于形成生物胺[24],而豆瓣醬發(fā)酵過程總生物胺和腐胺與pH均呈現(xiàn)正相關(guān),可能是由于豆瓣醬屬于開放式混菌發(fā)酵體系,反應(yīng)較為復(fù)雜。

    表3 豆瓣醬發(fā)酵過程中環(huán)境變量與生物胺的相關(guān)性Table 3 Correlations between environmental variablesand biogenic amines during the fermentation of thebroad bean paste

    注:r為皮爾遜相關(guān)系數(shù),P<0.05為顯著相關(guān)

    2.3 豆瓣醬發(fā)酵過程中氨基酸含量的變化及其與生物胺相關(guān)性分析

    生物胺的積累依賴于有豐富的氨基酸前體的存在,為了探究生物胺與其前體氨基酸的關(guān)系,對(duì)發(fā)酵過程中游離氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè)。從圖4可以看出,豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中主要游離氨基酸有谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬氨酸等??傆坞x氨基酸含量在制曲階段略有下降后,但隨著發(fā)酵的進(jìn)行又逐漸上升。而精氨酸和鳥氨酸作為腐胺的前體氨基酸,在制曲階段急劇下降,這與之前得到的腐胺在制曲階段急速上升的結(jié)果一致。同時(shí)精氨酸在加鹽水發(fā)酵后上升至0.351 g/100 g,然后隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低,可能由于加鹽水發(fā)酵,腐胺的生成受到抑制導(dǎo)致精氨酸的積累,隨著發(fā)酵的進(jìn)行又經(jīng)AgDI途徑生成腐胺,并進(jìn)一步在亞精胺合成酶的作用下生成亞精胺以及精胺。

    對(duì)豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中生物胺與其前體物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析(表4)。結(jié)果表明,精氨酸作為腐胺的前體,與腐胺有一定的負(fù)相關(guān)性,與亞精胺顯著正相關(guān);而腐胺作為亞精胺的前體與亞精胺也呈現(xiàn)一定的相關(guān)性;其他生物胺與其前體之間沒有顯著相關(guān)性。所以,在一定程度上,游離氨基酸作為生物胺的前體物質(zhì)與生物胺之間有較強(qiáng)的聯(lián)系,控制豆瓣醬發(fā)酵過程中游離氨基酸的含量可能成為一種控制生物胺的手段。

    圖4 豆瓣醬發(fā)酵過程中游離氨基酸含量Fig.4 Contents of free amino acids during the fermentation of broad bean paste

    表4 豆瓣醬發(fā)酵過程中氨基酸與生物胺的相關(guān)性研究Table 4 Correlations between amino acids and biogenicamines during the fermentation of the broad bean paste

    注:*表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān);**表示在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

    3 結(jié)論

    為了探究豆瓣醬工業(yè)發(fā)酵過程中生物胺的生成規(guī)律,本研究采用高效液相色譜對(duì)豆瓣醬發(fā)酵過程中生物胺含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,豆瓣醬發(fā)酵過程中主要生物胺為腐胺、亞精胺與精胺;腐胺在第0天為50.67 mg/kg,制曲結(jié)束后,迅速升至最大值134.96 mg/kg,隨著發(fā)酵的進(jìn)行腐胺逐漸降低至26.42 mg/kg。而亞精胺與精胺則在第0天存在,制曲結(jié)束后降低至5 mg/kg以內(nèi),隨后逐漸增加至20 mg/kg左右,變化不明顯。

    本研究通過對(duì)理化參數(shù)和各種生物胺含量的相關(guān)分析,探究環(huán)境因素對(duì)各種生物胺的影響。在豆瓣醬發(fā)酵過程中,腐胺與含水量、pH、鹽含量具有很大的相關(guān)性;而亞精胺與含水量、氨基態(tài)氮、總酸及鹽含量均顯著相關(guān)??偵锇泛颗c含水量、pH、氨基態(tài)氮、總酸及鹽含量顯著相關(guān)。而豆瓣醬在發(fā)酵過程中,精氨酸與腐胺有一定的相關(guān)性,與亞精胺顯著相關(guān);而腐胺與亞精胺呈顯著相關(guān),其他生物胺與其前體之間并沒有顯著相關(guān)性。然而豆瓣醬發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜開放的混菌發(fā)酵體系,因此想要清晰生物胺形成規(guī)律的具體原因,未來需進(jìn)一步研究微生物對(duì)發(fā)酵豆瓣醬中生物胺生成的具體影響,以期從微生物角度去調(diào)控生物胺的含量。

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