MiR-123調(diào)控Bcl-2對宮頸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響*

趙 敏，趙 琳，鐘社蘭

陜西省安康市人民醫(yī)院（安康725000）

宮頸癌是女性發(fā)病率和致死率較高的腫瘤之一，在部分大中城市已成為女性發(fā)病率最高的癌癥。當(dāng)前該病的主要治療方法為手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療等，顯著降低了宮頸癌的病死率［1］。有報(bào)道顯示Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期宮頸癌的5年生存率分別為60%左右、45%左右與15%左右［2-3］?，F(xiàn)代研究顯示宮頸癌的產(chǎn)生與發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多階段發(fā)展的復(fù)雜事件［4］。微小RNA（MiRNA，MiR）是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)、長度大約為18～25 nt的非編碼小單鏈RNA 分子，具有表達(dá)時(shí)序性、組織特異性、高度保守性等特點(diǎn)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、病毒防御、脂肪代謝等多個(gè)生物學(xué)過程［5-6］。MiR-123 普遍被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，可調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)階段，也可能和惡性腫瘤化療耐藥性的產(chǎn)生有一定的相關(guān)關(guān)系［7］。B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因是一個(gè)原癌基因，可抑制惡性腫瘤的凋亡和壞死［8］。本文具體探討了miR-123調(diào)控Bcl-2對宮頸癌侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌細(xì)胞Hela購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，培養(yǎng)于含有10%血清（美國Gibico公司）的DMEM 培養(yǎng)基（美國BD 公司）中（培養(yǎng)條件37℃與5%CO2）。CCK-8檢測試劑盒購自上海生工公司，青鏈霉素混合液購自國藥集團(tuán)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司，Transwell小室購自日本TAKARA 公司，抗Bcl-2抗體與抗AKT 抗體購自美國Sigma公司，hsa-MiR-123 mimics、negative control購自上海吉瑪公司。

2 研究方法

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入12孔板，每孔加入1 ml培養(yǎng)基，再加入含有細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)的細(xì)胞懸液，孵育12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。MiR-123組與對照組分別轉(zhuǎn)染hsa-MiR-123 mimics、negative control（陰性對照），轉(zhuǎn)染體積為100μl，空白組轉(zhuǎn)染等體積的磷酸鹽緩沖液。

2.2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用胰酶將細(xì)胞消化，種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞（100μl），每組各3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)后每個(gè)孔加入10μl CCK-8檢測試劑，放入孵箱內(nèi)反應(yīng)2 h，然后放入酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度（A450 nm）檢測，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

2.3 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):將Matrigel matrix基質(zhì)膠取出融化，用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，取100μl鋪于Transwell小室內(nèi)，取出24 孔板，下層加入600 μl的有血清培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞24 h后消化處理，小室內(nèi)加入1×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)放入的是不帶基質(zhì)膠的小室，侵襲實(shí)驗(yàn)放入帶基質(zhì)膠的小室，然后進(jìn)行常規(guī)孵育。然后加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，重新加入600μl的結(jié)晶紫，晾干后觀察細(xì)胞狀況，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)并計(jì)算細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移指數(shù)。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行消化，1000 r／min離心5 min，用結(jié)合緩沖液使細(xì)胞重懸，并向管內(nèi)加入5μl的加異硫氰酸熒光素（FITC），混勻后4℃避光放置15 min。再加入10μl的碘化丙啶（PI）溶液，混勻后4℃避光放置5 min。上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后收集并裂解細(xì)胞，提取并定量總蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸10 min，緩慢冷卻后上樣，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，洗滌3次后加入二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次后進(jìn)行成像，記錄Bcl-2、AKT 蛋白相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS 22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布時(shí)對比采用t檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布則采用Mann-Whitney分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

結(jié) 果

1 細(xì)胞增殖指數(shù)對比 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、36 h，MiR-123組的細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖指數(shù)對比（%）

2 細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移指數(shù)對比 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、36 h，MiR-123組的細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移指數(shù)顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移指數(shù)對比（%）

3 細(xì)胞凋亡指數(shù)對比 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、36 h，MiR-123組的細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 三組轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡指數(shù)對比（%）

4 Bcl-2蛋白表達(dá)水平對比 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h，MiR-123組的Bcl-2、AKT 蛋白相對表達(dá)水平顯著低于對照組與空白組（P＜0.05），對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4、圖1。

表4 三組轉(zhuǎn)染后36 h Bcl-2、AKT蛋白相對表達(dá)水平對比（±s）

表4 三組轉(zhuǎn)染后36 h Bcl-2、AKT蛋白相對表達(dá)水平對比（±s）

注:與對照組對比，*P＜0.05；與空白組對比，△P＜0.05

組 別 n Bcl-AKT MiR-123組 3 0.67±0.13*△ 0.89±0.12 2*△對照組 3 2.31±0.13 2.45±0.14空白組3 2.41±0.0 2.49±0.33

圖1 三組Bcl-2、AKT 蛋白表達(dá)水平

討 論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)主要的婦科腫瘤之一，我國每年新發(fā)病例13～15 萬，年輕患者發(fā)病率呈上升趨勢。手術(shù)為該病的主要治療方法，能顯著提高患者的生存率，但是很多患者術(shù)后仍存在復(fù)發(fā)情況，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。特別是單純手術(shù)治療很難根治腫瘤復(fù)發(fā)，多需要聯(lián)合綜合治療手段。miRNA 在細(xì)胞增殖與凋亡、個(gè)體發(fā)育等生理活動(dòng)中起重要調(diào)控作用，也與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移以及多藥耐藥性密切相關(guān)［9］。不過miRNA 對靶基因的調(diào)節(jié)不是簡單的對應(yīng)關(guān)系，而是一種錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系［10］。細(xì)胞通過增殖產(chǎn)生新的細(xì)胞，是機(jī)體生長發(fā)育和種族延續(xù)的基礎(chǔ)；腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移是腫瘤的最重要的特點(diǎn)；凋亡是細(xì)胞的一種程序性的正常死亡過程，是目前抗腫瘤基因治療的重要方面［11］。本研究顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、36 h，MiR-123組的細(xì)胞增殖指數(shù)、侵襲及轉(zhuǎn)移指數(shù)顯著低于對照組與空白組，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組與空白組，對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明高表達(dá)MiR-123 能促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究也顯示MiR-123可靶向PI3K 基因誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，能夠降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而提高細(xì)胞的存活率［12］。

隨著我國防癌普查工作的進(jìn)行及女性受教育水平的提高，宮頸癌的病死率均明顯下降，但是其發(fā)病率呈現(xiàn)一定的上升趨勢，且發(fā)病患者群越來越年輕化。局部宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)率為30%，特別是根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)的患者5年生存率僅為10%左右。宮頸癌發(fā)病與遺傳有顯著相關(guān)性，由于內(nèi)外在致病因素誘發(fā)與宮頸癌相關(guān)基因突變，從而導(dǎo)致宮頸癌的形成。腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路在機(jī)體生命過程中發(fā)揮重要作用，部分耐藥惡性腫瘤細(xì)胞的Bcl-2／AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在耐藥細(xì)胞處于異?；钴S狀［13］。Bcl-2可與細(xì)胞內(nèi)含有PH 結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白AKT 結(jié)合，促使AKT 蛋白的活化，激活或抑制其下游靶蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖、分化、凋亡等［14］。Bcl-2／AKT 信號(hào)通路上相關(guān)基因的突變、錯(cuò)配、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)置、DNA 異常甲基化可導(dǎo)致一系列的遺傳及表觀遺傳上的改變，從而誘發(fā)耐藥的產(chǎn)生［15］。本研究顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h，MiR-123 組的Bcl-2、AKT 蛋白相對表達(dá)水平顯著低于對照組與空白組，對照組與空白組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從機(jī)制上分析，MiR-123為一種抑癌因子，MiR-123過表達(dá)可以抑制Bcl-2／AKT 信號(hào)通路的激活，從而抑制細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。

總之，過表達(dá)MiR-123能抑制Bcl-2／AKT 通路的激活，從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用。