沉默TUG1基因?qū)Ω伍T(mén)部膽管癌QBC939細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響

車(chē) 宇，梁 靜，楊怡萍，廖 娟，王 蒨，蔡英全，邵 帥

陜西省腫瘤醫(yī)院放療科（西安710061）

肝門(mén)部膽管癌起源于肝門(mén)部膽管內(nèi)皮，具有高度的侵襲性，其發(fā)病率占膽管癌總體發(fā)病率的50%～80%［1］。流行病學(xué)研究顯示，近些年來(lái)肝門(mén)部膽管癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，是惡性程度最高的腫瘤之一［2］。根治性手術(shù)為目前治療肝門(mén)部膽管癌最有效的方法。然而，肝門(mén)部膽管癌起病隱匿，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，由于腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者失去最佳治療時(shí)機(jī)。此外，盡管中西醫(yī)結(jié)合的綜合治療方案能顯著延長(zhǎng)腫瘤患者生存周期［3］。但是，肝門(mén)部膽管癌術(shù)后易發(fā)生局部復(fù)發(fā)，即使患者接受了根治性手術(shù)治療和中西醫(yī)結(jié)合綜合治療方案，術(shù)后5年生存率仍小于30%［4］。為了改善肝門(mén)部膽管癌的治療效果，尋找與肝門(mén)部膽管癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子靶點(diǎn)也顯得尤為迫切。微小RNA（microRNA，miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，Lnc RNA）是非編碼RNA 家族的兩個(gè)主要成員。已有大量研究表明miRNA 在膽管癌發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［5］。然而，關(guān)注LncRNA 在膽管癌發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究尚不多見(jiàn)。Lnc RNA 為轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 nt 不具備蛋白編碼功能的一類RNA［6］。研究表明，Lnc RNA 作為染色體組裝、轉(zhuǎn)錄層面以及轉(zhuǎn)錄后層面的關(guān)鍵調(diào)控因子而參與幾乎所有的生理進(jìn)程［7-8］。?；撬嵘险{(diào)基因1（Taurine-upregulated gene 1，TUG1）是大小為7.1 kb的LncRNA，首次發(fā)現(xiàn)于?；撬崽幚淼男∈笠暰W(wǎng)膜細(xì)胞上調(diào)表達(dá)的基因中［9］。研究表明肝內(nèi)膽管癌織中上調(diào)的TUG1 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-145 而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［10］。然而，另有研究表明TUG1在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)調(diào)控CyclinD1和CDK 的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［11］。但在肝門(mén)部膽管癌中TUG1的功能和潛在機(jī)制尚不清楚。本研究擬深入闡明肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系QBC939中TUG1表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 TRIzol試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于Ta KaRa公司，TUG1-siRNA 由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，LipofectamineTM2000 試 劑 購(gòu) 于Invitrogen 公 司，MTT 試 劑 盒 購(gòu) 于Promega公司；FITC標(biāo)記的Annexin-V及PI試劑購(gòu)于BD公司，人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系HIBEpic和肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系QBC939均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系HIBEpic和肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系QBC939 采用1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，其中含胎牛血清濃度為100μl／ml。細(xì)胞培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度37℃，CO2濃度設(shè)置為5%。當(dāng)細(xì)胞匯合度至70%～80%行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamineTM2000。配置轉(zhuǎn)染反應(yīng)液A:5 μl TUG1-siRNA 或TUG1 NC+250μl無(wú)血清培養(yǎng)基；配置轉(zhuǎn)染反應(yīng)液B:5μl轉(zhuǎn)染試劑+250μl無(wú)血清培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染反應(yīng)液A 與B混合，孵育15 min，逐滴滴加至QBC939細(xì)胞中。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染TUG1 siRNA 的QBC939細(xì)胞命名為T(mén)UG1-siRNA 組，將轉(zhuǎn)染TUG1 NC 的QBC939細(xì)胞命名為T(mén)UG1-NC組。

2.2 TUG1表達(dá)水平檢測(cè):待肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1-siRNA 及TUG1-NC 48 h后，收集細(xì)胞，用TRIzol裂解TUG1-siRNA 組、TUG1-NC 組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 作為qRT-PCR 模板。配置qRT-PCR 反應(yīng)液，TUG1正向引物及反向引物各1μl、2×qRT-PCR 反應(yīng)液10μl、熱啟動(dòng)Taq 酶1μl、cDN 模 板1μl、去 離 子 水6μl。qRT-PCR 的反應(yīng)條件設(shè)置為:95℃5 min預(yù)變性，而后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的95℃20 s變性，60℃30 s退火，68℃20 s延伸。根據(jù)2—ΔΔCt計(jì)算各組細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平。

2.3 MTT 法檢測(cè)QBC939的增殖:QBC939 細(xì)胞轉(zhuǎn)染TUG1-siRNA 及TUG1-NC 48 h 后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TUG1-siRNA 組和TUG1-NC組細(xì)胞，吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，PBS清洗細(xì)胞后離心。離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為1000 r／min，離心時(shí)間設(shè)定為5 min。再次重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種細(xì)胞至96孔板，每孔接種細(xì) 胞5000 個(gè)，每 組 細(xì) 胞 各 接 種9 孔，共 鋪6 個(gè)96 孔板。將接種細(xì)胞后的96孔板置于同一細(xì)胞培養(yǎng)箱后分別培養(yǎng)1～6 d。在第1～6天相同時(shí)間點(diǎn)，分別取出一板細(xì)胞，加入20μl MTT 溶液（濃度預(yù)先調(diào)整為1.5 g／L）。將滴加MTT 溶液的細(xì)胞再次放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后，加入120μl DMSO 溶液。細(xì)胞變色后，酶標(biāo)儀讀取TUG1-siRNA 組和TUG1-NC組吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)QBC939細(xì)胞凋亡:取轉(zhuǎn)染48 h 后 的TUG1-siRNA 組 和TUG1-NC 組QBC939細(xì)胞。胰酶消化后，吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，PBS 清洗細(xì)胞后離心。離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為1000 r／min，離心時(shí)間設(shè)定為5 min。重復(fù)清洗及離心步驟3 次后，加入100μl流式洗液重懸細(xì)胞。在避光狀態(tài)下向細(xì)胞中加入100μl 流式洗液和10μl Annexin-V 抗體（FITC標(biāo)記，濃度預(yù)先調(diào)整為20μg／ml）。室溫條件下避光反應(yīng)30 min。而后，再次加入5μl的PI染料（濃度預(yù)先調(diào)整為50μg／ml），室溫條件下避光反應(yīng)15 min。加入2 ml流式洗液后離心，離心條件同前。重復(fù)清洗及離心步驟3 次后，加入500μl流式洗液，重懸細(xì)胞后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)TUG1-siRNA 組和TUG1-NC組細(xì)胞凋亡情況。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)QBC939細(xì)胞周期:取轉(zhuǎn)染TUG1-siRNA 及TUG1-NC 48 h后的TUG1-siRNA組和TUG1-NC組QBC939細(xì)胞。胰酶消化后，吹散細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，PBS清洗細(xì)胞后離心。離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為1000 r／min，離心時(shí)間設(shè)定為5 min。重復(fù)清洗及離心步驟3次后，加入100μl流式洗液重懸細(xì)胞。在避光狀態(tài)下向細(xì)胞中加入5μl PI染料（濃度預(yù)先調(diào)整為50μg／ml）。在避光環(huán)境反應(yīng)10 min后，加入400 μl 流式洗液。立即利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TUG1-siRNA 組和TUG1-NC組細(xì)胞周期。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)本研究所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)分析兩組間數(shù)據(jù)的差異，以P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TUG1在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系與肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá) 分別提取人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系HIBEpic和肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系QBC939 細(xì)胞的總RNA，各自反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光實(shí)時(shí)定量RTQPCR 檢測(cè)各組間TUG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在QBC939細(xì)胞中TUG1表達(dá)較HIBEpic中明顯上調(diào)（t=10.936，P＜0.01），見(jiàn)圖1。

2 TUG1-siRNA 下調(diào)QBC939細(xì)胞中TUG1的表達(dá) 轉(zhuǎn)染TUG1-NC 及TUG1-siRNA 于肝門(mén)部膽管癌QBC939細(xì)胞48 h后，分別提取TUG1-NC組及TUG1-siRNA 組細(xì)胞總RNA，各自反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光實(shí)時(shí)定量RT-QPCR 檢測(cè)TUG1-NC 組及TUG1-siRNA 組中TUG1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在QBC939細(xì)胞中，TUG1-siRNA 組中TUG1表達(dá)較TUG1-NC組明顯下調(diào)（t=8.827，P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖1 HIBEpic和QBC939細(xì)胞中TUG1表達(dá)水平

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)TUG1 siRNA 的沉默效率

3 TUG1-siRNAs抑制QBC939 細(xì)胞的增殖 MTT 檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染TUG1-NC與TUG1-siRNA 的QBC939細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力差異，TUG1-siRNA 組細(xì)胞的增殖能力明顯弱于TUG1-NC 組細(xì)胞，兩組細(xì)胞增殖能力比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.827，P=0.014），TUG1可顯著促進(jìn)QBC939細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖3。

圖3 TUG1-siRNA 抑制QBC939細(xì)胞增殖能力

4 TUG1-siRNAs促進(jìn)QBC939 細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染TUG1-NC 與TUG1-siRNA 的QBC939 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平差異，TUG1-siRNA 組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比例明顯高于TUG1-NC組（t=3.291，P=0.028），提示TUG1可抑制QBC939細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖4。

5 TUG1-siRNAs阻滯QBC939細(xì)胞于G1期 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染TUG1-NC 與TUG1-siRNA 的QBC939 細(xì)胞的細(xì)胞周期分布差異，轉(zhuǎn)染TUG1-siRNA 細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例明顯高于TUG1-NC組（t=3.293，P=0.023），而轉(zhuǎn)染TUG1-siRNA細(xì)胞的S期細(xì)胞明顯少于TUG1-NC組（t=2.892，P=0.027），見(jiàn)圖5。

圖4 TUG1-siRNA 增強(qiáng)QBC939細(xì)胞凋亡水平

討 論

Lnc RNA 的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)極大的改變了我們對(duì)于腫瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。近來(lái)，越來(lái)越多研究表明腫瘤中異常表達(dá)的Lnc RNA 在腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤侵襲等多方面扮演著重要的作用［12-13］。LncRNA MALAT1可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-204 表達(dá)而調(diào)控CXCR4的表達(dá)，從而促進(jìn)肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞增殖、侵襲 及 轉(zhuǎn) 移［14］。LncRNA-PVT1 通 過(guò) 與PCR2 復(fù) 合 體結(jié)合而調(diào)控ANGPTL4組蛋白甲基化水平，從而抑制其表達(dá)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖抑制其凋亡［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)Lnc RNA EPIC1在膽管癌患者組織中表達(dá)異常上調(diào)，并可通過(guò)抑制Myc的表達(dá)而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力［16］。然而，目前肝內(nèi)膽管癌發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中LncRNA 所發(fā)揮功能的相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。

圖5 TUG1 siRNA 阻滯細(xì)胞周期于G1期

本研究檢測(cè)了人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpic與肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系QBC939中TUG1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TUG1 在QBC939 中的表達(dá)顯著高于HIBEpic中的表達(dá)，提示TUG1可能在肝門(mén)部膽管癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。最新研究顯示，LncRNA 的表達(dá)可被一些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。TUG1被證實(shí)作為腫瘤抑制LncRNA 并 被p53 調(diào) 控［17］。然 而，另 有 研 究 報(bào) 道TUG1 可作為致癌LncRNA 被轉(zhuǎn)錄因子SP1 調(diào)控［18］。為了進(jìn)一步明確TUG1在肝門(mén)部膽管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們利用RNA 干擾技術(shù)沉默QBC939細(xì)胞中TUG1的表達(dá)，研究TUG1對(duì)肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默QBC939細(xì)胞TUG1的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力明顯降低，以上結(jié)果提示TUG1 可以增強(qiáng)肝門(mén)部膽管癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。與此同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡水平的增加、G1期細(xì)胞比例增多、S 期細(xì)胞比例減少，可能是TUG1-siRNA 抑制肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞的潛在機(jī)制。以上結(jié)果提示TUG1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡和周期而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究檢測(cè)了正常肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞與肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞中TUG1 的表達(dá)差異，并利用RNA 干擾技術(shù)沉默QBC939 細(xì)胞中TUG1 的表達(dá)，檢測(cè)TUG1 在QBC939 細(xì)胞增殖、凋亡、周期中的作用。研究發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 表達(dá)可以抑制肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞的凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期。本研究為進(jìn)一步研究肝門(mén)部膽管癌發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中TUG1所發(fā)揮的調(diào)控作用的潛在機(jī)制奠定了初步的理論基礎(chǔ)，也同時(shí)有望為肝門(mén)部膽管癌的分子治療提供潛在靶點(diǎn)。