葒草苷對(duì)APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究*

張 澤，韓 錕，賈 寧

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（錦州121001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種發(fā)生于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。研究表明［1-3］，AD 患者腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）及其功能性酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B，Trk B）受體表達(dá)減少。BDNF 屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員，在神經(jīng)再生的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其作用于Trk B受體，發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡、改善認(rèn)知功能的作用。腦內(nèi)大量的β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的老年斑是AD特征性病理改變之一，而Aβ1-42 是老年斑的主要成分［4］。葒草苷（Orientin，Ori）是一種水溶性碳苷類黃酮化合物，為葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗炎、抗凋亡等多種神經(jīng)保護(hù)作用，能夠改善癡呆小鼠的認(rèn)知功能［5-7］。本文以APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，研究Ori對(duì)此動(dòng)物模型BDNF和Trk B受體的作用，以及對(duì)Aβ沉積的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物:10月齡APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠24只，同月齡同背景C57BL／6J小鼠8 只，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào):SYXK（遼）2012-007］。藥品與試劑:葒草苷（純度≥99%）購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；兔抗BDNF 抗體、兔抗TrkB受體抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Aβ1-42 ELISA 試劑盒購(gòu)于Invitrogen 公司。儀器:Morris水迷宮（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)bio-rad公司）；紫外分光光度計(jì)（德國(guó)Biophotometer）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與處理:將APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分成三組，即模型組（Tg組）、Ori低劑量組（Tg／Ori-L組）和Ori高劑量組（Tg／Ori-H 組），對(duì)照組（NT 組）為同月齡同背景C57BL／6J小鼠。每組小鼠8只，雌雄各半，體重（25±3）g，各組小鼠體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥方法:NT 組和Tg組每天給予雙蒸水5 ml腹腔注射，Tg／Ori-L 組和Tg／Ori-H 組每天分別給予Ori 10、50 mg／kg 5 ml腹腔注射，均給藥4周。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)檢測(cè):給藥結(jié)束24 h后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。實(shí)驗(yàn)程序參照Morris等方法進(jìn)行［8-9］，檢測(cè)各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3 Western blot檢測(cè)BDNF 和Trk B 受體的蛋白表達(dá):提取各組小鼠海馬的總蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。40μg蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用5%牛奶封閉，加入一抗（BDNF，1∶500；Trk B 受體，1∶500；β-actin，1∶4000）4 ℃孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗常溫孵育1 h。ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image J軟件分析。

2.4 ELISA 法檢測(cè)海馬區(qū)Aβ1-42水平:將各組小鼠的腦組織稱重，加入8倍體積的鹽酸胍裂解液研磨，室溫下靜置3～4 h。用反應(yīng)緩沖液1∶50稀釋樣品后離心20 min，取上清用于可溶性Aβ1-42的測(cè)定，離心管底部沉淀再用70%甲酸溶解后離心1 h，收集上清液用于不可溶性Aβ1-42的測(cè)定。取標(biāo)準(zhǔn)品按說明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各50μl分別加入微量酶標(biāo)板內(nèi)，立即向每孔加入50μl Aβ1-42抗體，置搖床室溫孵育3 h。反復(fù)洗板4 次，室溫孵育30 min。每孔加100μl染液覆蓋，37 ℃孵育30 min。取出酶標(biāo)板，每孔加終止液100μl，輕輕混勻，直至孔中的液體由藍(lán)變黃?？瞻卓渍{(diào)零，30 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)讀取光密度（OD 值），根據(jù)曲線方程求出腦組織中Aβ1-42的濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 Ori改善APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 各組小鼠定位航行試驗(yàn)顯示，尋找平臺(tái)逃避潛伏期（圖1A）及平均路程（圖1B）隨著測(cè)試時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸縮短。與NT 組相比，Tg組小鼠逃避潛伏期和尋找平臺(tái)平均路程延長(zhǎng)（P＜0.05），經(jīng)Ori治療后均顯著縮短（P＜0.05），表明APP／PS1小鼠具有明顯的空間學(xué)習(xí)障礙，Ori可以改善其能力?？臻g探索試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，Tg組小鼠穿梭原平臺(tái)所在象限次數(shù)顯著減少（P＜0.05），經(jīng)Ori治療后次數(shù)均明顯增加（P＜0.05），提示APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶再現(xiàn)能力降低，Ori可改善其能力。與Tg／Ori-L 組比較，Tg／Ori-H 組逃避潛伏期、尋找平臺(tái)平均路程和穿梭原平臺(tái)所在象限次數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明Ori改善APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力無劑量相關(guān)性。

圖1 各組小鼠尋找平臺(tái)逃避潛伏期（A）和尋找平臺(tái)平均路程（B）比較

圖2 各組小鼠穿梭原平臺(tái)所在象限次數(shù)比較

2 Ori調(diào)節(jié)APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)BDNF和Trk B受體蛋白表達(dá) 見圖3。Western blot結(jié)果顯示，與NT 組比較，Tg 組小鼠海馬BDNF 和TrkB受體蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；與Tg組相比，Tg／Ori-L組和Tg／Ori-H 組小鼠海馬BDNF 和TrkB 受體蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；Tg／Ori-H 組小鼠海馬BDNF和TrkB受體蛋白表達(dá)與Tg／Ori-L 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 Ori減輕APP／PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)Aβ1-42水平 見表1。ELISA 結(jié)果顯示，Tg組小鼠海馬區(qū)可溶性Aβ1-42含量及不可溶性Aβ1-42含量較NT 組明顯增高（P＜0.05）；與Tg組比較，Tg／Ori-L 組和Tg／Ori-H 組小鼠海馬區(qū)可溶性Aβ1-42含量和不可溶性Aβ1-42含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Tg／Ori-L組比較，Tg／Ori-H 組小鼠海馬區(qū)可溶性和不可溶性Aβ1-42含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠海馬區(qū)BDNF和Trk B受體蛋白表達(dá)比較

表1 各組小鼠海馬區(qū)可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比較（±s）

表1 各組小鼠海馬區(qū)可溶性及不可溶性Aβ1-42含量比較（±s）

注:與NT 組比較，#P＜0.05；與Tg組比較，*P＜0.05

組 別 可溶性Aβ1-42（pg／mg）不可溶性Aβ1-4（ng／mg）NT 組24.05±4.98 42.06±6.98 Tg組 67.05±8.15# 112.03±11.23#Tg／Ori-L組 32.31±6.32* 76.35±6.42*Tg／Ori-H 組 39.17±9.86* 71.05±7.35*

討 論

Ori是一種水溶性碳苷類黃酮化合物，為葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分。研究表明［1-3］:Ori具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗炎、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)作用，能夠改善Aβ以及噪音誘導(dǎo)的癡呆小鼠的認(rèn)知功能。但Ori改善癡呆小鼠認(rèn)知功能的機(jī)制目前尚不清楚。

BDNF／Trk B是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)保護(hù)信號(hào)通路之一，其中BDNF 廣泛分布于海馬、皮質(zhì)和杏仁核等區(qū)域［10］，通過與細(xì)胞膜上的Trk B 受體特異性結(jié)合而激活酪氨酸蛋白激酶，引起酪氨酸殘基的磷酸化，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化和成熟神經(jīng)元的存活，提升海馬神經(jīng)元在損傷環(huán)境下的自我修復(fù)及適應(yīng)能力，調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，增強(qiáng)突觸可塑性，維持AD 病理環(huán)境中樹突的形態(tài)和功能，最終改善認(rèn)知功能［11-12］。研究表明［13-14］:AD 動(dòng)物模型及患者BDNF和Trk B受體表達(dá)均下降，并與年齡和病程呈負(fù)相關(guān)，給予癡呆動(dòng)物模型外源性導(dǎo)入BDNF 則有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，減少了Aβ沉積，從而改善了模型的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究中模型組小鼠海馬BDNF／Trk B含量下降，從而導(dǎo)致Aβ1-42 含量增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15］。Ori可上調(diào)小鼠海馬區(qū)BDNF／TrkB 的表達(dá)，減少Aβ1-42的含量。Aβ沉積形成的老年斑是AD 的經(jīng)典病理改變，Aβ的生成與清除失衡是AD 的核心發(fā)病機(jī)制。在體和離體實(shí)驗(yàn)均表明BDNF 能通過下調(diào)腦Aβ的表達(dá)減少老年斑的形成，保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元、顆粒細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等，從而使神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ多聚體的細(xì)胞毒性損傷，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活能力［15］。本研究中APP／PS1轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦內(nèi)BDNF 和TrkB受體表達(dá)減少，Ori能上調(diào)BDNF 和TrkB 受體表達(dá)，進(jìn)而減少海馬Aβ沉積，從而提高了空間學(xué)習(xí)記憶能力。但本研究中Ori影響癡呆動(dòng)物模型BDNF／Trk B表達(dá)無劑量依賴關(guān)系，仍需進(jìn)一步分組研究。