組織激肽釋放酶7高表達(dá)前列腺癌PC-3單克隆細(xì)胞株的構(gòu)建及其侵襲性研究*

呂文鑫，莫曾南，楊小麗

1.廣西壯族自治區(qū)柳州市工人醫(yī)院（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院）泌尿外科（柳州545005）；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧530021）；3.廣西醫(yī)科大學(xué)基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究中心（南寧530021）；4.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（南寧530021）

前列腺癌為臨床常見惡性腫瘤，其在西方國(guó)家男 性惡性腫瘤發(fā)生率中高居首位。其在我國(guó)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，目前已成為成年男性最常見的惡性腫瘤之一。組織激肽釋放酶7（Kallikrein7，KLK7）為編碼h K7蛋白的人類組織肽釋放酶基因。相關(guān)研究中顯示，KLK7可在多種惡性腫瘤中檢出，并呈現(xiàn)異常表達(dá)狀態(tài)，考慮其可能為某些腫瘤的分子標(biāo)記物［1-2］。其中，人前列腺特異性抗原（PSA／KLK3）就是該家族成員。為了進(jìn)一步明確其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，本研究擬構(gòu)建過表達(dá)KLK7 基因的前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株，同時(shí)探討對(duì)其前列腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 菌種:TOP10感受態(tài)菌（美國(guó)Invitrogen公司）；質(zhì)粒:pcDNA3.1克隆表達(dá)載體（美國(guó)Invitrogen公司）；細(xì)胞:人類前列腺癌細(xì)胞系PC-3（中國(guó)科學(xué)院生物細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)）。主要試劑:反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ta KaRa公司）、DNA 聚合酶與限制性內(nèi)切酶Kpn（Ta KaRa 公 司）；LB 培 養(yǎng) 基、TRIzol Reagent試 劑、Lipofectamine 2000試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；PCR相關(guān)試劑（上海生物工程有限公司）；抗體（Abcam）；細(xì)胞培養(yǎng)試劑（Gibco公司）；蛋白分子量Marker（賽百勝公司）。

2 研究方法

2.1 PCR 擴(kuò)增:①以Trizol法提取前列腺組織上皮細(xì)胞RNA，-80℃保存；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，后PCR 擴(kuò)增。將KOZAK 系列引入引物設(shè)計(jì)中以提升蛋白表達(dá)效率。上游引物:5'ACCATGGCAAGA TCCCTTCTCC3'；下游引物5′TTAGCGATGCTTTTT CATGGTGTC3'。②反應(yīng)條件:95℃5 min，循環(huán)1次；95℃、56℃、72℃各1 min，循環(huán)35次；72℃10 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳（1.7%瓊脂糖膠），并系統(tǒng)檢測(cè)。

2.2 構(gòu)建表達(dá)載體:①表達(dá)載體選pcDNA3.1；將PCR 產(chǎn)物電泳完成后切膠純化，將pcDNA3.1 載體與產(chǎn)物以T4DNA 連接酶連接；轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)菌；②以LB 瓊脂平板進(jìn)行Amp 抗性陽性克隆篩選，挑菌培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提?。虎勖盖需b定重組后質(zhì)粒，并實(shí)施DNA 測(cè)序，將測(cè)得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行比較。

2.3 前列腺癌PC-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:①將前列腺癌細(xì)胞PC-3置于100 U／ml鏈霉素F12、100 U／ml青霉素、10%胎牛血清培養(yǎng)液中，存放于5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取PC-3對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞種于24孔板中，種植標(biāo)準(zhǔn)為2×105細(xì)胞／孔密度，過夜后將細(xì)胞匯合；②陽離子脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染；③24 h后細(xì)胞去舊培養(yǎng)液并重新培養(yǎng)，后進(jìn)行細(xì)胞篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為500 μg／ml G418；④對(duì)照為空載體；⑤單克隆細(xì)胞篩選完成后實(shí)施細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.4 穩(wěn)定細(xì)胞株鑒定:①鑒定方式選Western blot法，取對(duì)照細(xì)胞及pcDNA3.1-KLK7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞帶，定量后電泳（丙烯酰胺凝膠），后將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜；②在室溫下進(jìn)行1%BSA 的TBST 封閉，封閉時(shí)間為1 h，并加一抗（1∶500）搖床4℃過夜孵育；③TBST洗膜，加二抗（1∶5000）實(shí)施1 h 室溫孵育；④洗膜，ECL發(fā)光后實(shí)施顯影定影。

2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):采用DMEM 將Matrigel稀釋（1∶6），100μl／孔加入Transwell小室，37℃放置1 h，加入600μl含20%FBS的DMEM 培養(yǎng)基，平衡1 h；2×104細(xì)胞接種至Transwell上室、鋪勻。在下室內(nèi)加入含20%FBS的DMEM 培養(yǎng)基600μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，甲醛固定30 min，PBS沖洗、晾干，0.1%結(jié)晶紫染色。光學(xué)顯微鏡放大40倍下隨機(jī)觀察5個(gè)視野并拍照，對(duì)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)并比對(duì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以單因素方差分析（ANOVA）比較多組間數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié) 果

1 pcDNA3.1-KLK7載體酶切鑒定 取抽提后質(zhì)粒實(shí)施酶切（KpnI限制性內(nèi)切酶），載體構(gòu)圖（圖1）。因KLK7開放讀碼框、pcDNA3.1載體上各存在1個(gè)酶切位點(diǎn)，因此酶切插入方向正確后電泳條帶顯示686bp（圖2）。對(duì)預(yù)期相符質(zhì)粒DNA 測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 pcDNA3.1-KLK7結(jié)構(gòu)及酶切位點(diǎn)位置示意圖

圖2 載體Kpn I限制性內(nèi)切酶酶切電泳圖

2 PC-3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的KLK7表達(dá)鑒定 蛋白免疫印跡結(jié)果（圖3）。PC-pcDNA3.1-K7細(xì)胞有特異條帶，相同位置對(duì)照空載體無目標(biāo)條帶；特意條帶大小與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明經(jīng)PC-3中h K7蛋白成功表達(dá)，而對(duì)照組細(xì)胞不表達(dá)h K7蛋白。選擇表達(dá)水平較高的陽性細(xì)胞，用于細(xì)胞侵襲性的研究。

3 前列腺癌PC-3 單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定過表達(dá) KLK7的細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），40倍鏡放大下5個(gè)隨機(jī)視野，轉(zhuǎn)染的PC-3-KLK7細(xì)胞組平均細(xì)胞計(jì)數(shù)為（246.60±23.41）個(gè)／HP，對(duì)照的PC-3細(xì)胞組平均細(xì)胞計(jì)數(shù)為（109.00±8.75）個(gè)／HP，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空載體細(xì)胞h K7表達(dá)比較

圖4 前列腺癌PC-3單克隆細(xì)胞株穩(wěn)定過表達(dá)KLK7的細(xì)胞侵襲試驗(yàn)（結(jié)晶紫染色，×40倍）

討 論

KLK7（Kallikrein 7）編碼h K7蛋白；該家族分子結(jié)構(gòu)保守，均表達(dá)絲氨酸蛋白酶活性［3］。h K7因具有糜蛋白酶活性，且最早被發(fā)現(xiàn)位置為皮膚角質(zhì)層，因此被稱為角質(zhì)層糜蛋白酶（SCCE），研究中發(fā)現(xiàn)h K7在皮屑生理、病理過程中均高度參與，主要原因?yàn)閔 K7能夠降解角質(zhì)層細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)，以此可造成細(xì)胞脫落層［4］。

近年來大量研究顯示人體多個(gè)器官惡性腫瘤的發(fā)生與h K7異常表達(dá)具有相關(guān)性，例如在對(duì)甲狀腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸癌及前列腺癌等涉及人體多個(gè)系統(tǒng)器官的研究中均發(fā)現(xiàn)h K7均存在表達(dá)異常情況［5-11］，這些腫瘤發(fā)生過程中既有激素依賴及非激素依賴，KLK7的表達(dá)有上調(diào)亦存在下調(diào)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)KLK7與E-cad在宮頸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者在促進(jìn)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移方面可能起協(xié)同作用［9］。高原紅細(xì)胞增多癥的患者同樣存在激肽釋放酶基因簇（KLK1／3／7／8／12）的過度表達(dá)［12］。裸鼠皮下移植瘤模型研究中，KLK7在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈高表達(dá)，是胰腺癌脈管侵犯的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；KLK7可促進(jìn)胰腺癌增殖，降低化療敏感性，增加胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力［13］。有學(xué)者研究表明KLK7可能作為檢測(cè)前列腺癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物［14］。在乳腺癌的治療中，激肽釋放酶相關(guān)肽酶是潛在的治療靶點(diǎn)［15］。但目前在腫瘤發(fā)展過程中h K7的影響機(jī)制尚仍不明確，但多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為其表達(dá)變化與腫瘤惡變情況相關(guān)［16-18］。

為深入研究其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中如何參與信號(hào)通路、對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)行為的影響等功能，需要進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞株中h K7蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。本次研究，選取前列腺癌最常見的PC-3細(xì)胞株進(jìn)行構(gòu)建，成功構(gòu)建出KLK7表達(dá)載體，并成功獲取不同表達(dá)量的PC-3穩(wěn)定細(xì)胞株，將KLK7過表達(dá)株篩選完成后并進(jìn)行下一步研究。同時(shí)，對(duì)KLK7過表達(dá)株的細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)表明，KLK7過表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞，具有更強(qiáng)的細(xì)胞表達(dá)，提示其可能在前列腺癌PC-3的腫瘤生物學(xué)特性中具有重要的作用，本研究可為惡性前列腺癌PC-3細(xì)胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移及其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。