CTRP3通過TGF-β1／Smad信號通路減弱肝星狀細胞活性機制研究*

徐志剛，曹 罡，程傳濤，盧 樂，侯宏義△

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院（西安710032）；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（西安710004）

肝纖維化是增加肝臟疾病并發(fā)癥及病死率的主要誘因，以細胞外基質(zhì)的過度合成沉積為特征，最終進展為肝硬化甚至肝癌［1］。肝臟星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）是肝組織中的間葉細胞，其活化在纖維化進程中起到關(guān)鍵作用［2］。已有研究證實，HSC 的活性可被一系列因子激活，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGFβ1）［3-4］。在肝 臟 組 織 中，TGF-β1 通 常 可 以 誘 導(dǎo)HSC增殖及細胞外基質(zhì)的合成［5］。因此，抑制HSC的活化在治療肝纖維化中至關(guān)重要。C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3（C1q tumor necrosis factor-related protein 3，CTRP3），作為CTRP家族其中一員，被認(rèn)為是一種新型脂肪因子，參與了多個細胞進程，比如細胞增殖、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、糖代謝及脂肪代謝等［6-9］，此外，也有研究表明CTRP3 在纖維化疾病中也發(fā)揮作用［10-11］。在TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞中，CTRP3可以減少結(jié)締組織生長因子的增殖、遷移及表達水平。然而，對于CTRP3 在肝纖維化中的作用知之甚少，本研究目的在于探明其在肝纖維化中的作用并探尋其可能的作用機制。

對象和方法

1 研究對象 組織樣本分別為11例正常肝組織（正常組）及11例肝纖維化組織（纖維化組），來源于我院普外科開腹手術(shù)所得（肝切除手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)病理確診后篩選）。所有樣本在-80℃儲存。所有參與本研究的患者，均簽署知情同意書。本研究已被西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。研究對象的一般資料，見表1。兩組之間的性別組成、年齡構(gòu)成，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組之間總膽紅素（TBA）、間接膽紅素（TB）、直接膽紅素（DB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ATL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）等肝功能指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組一般資料比較

2 HSC原代培養(yǎng) HSC培養(yǎng)采用組織貼塊外生長法。將手術(shù)切除的正常人肝臟組織在PBS 中洗去血液和其它附著物，剪切成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，置于6孔板中，用DMEM 培養(yǎng)基，加10%小牛血清、抗生素和谷氨酰胺，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下靜置培養(yǎng)。5～7 d后可見細胞從組織塊邊緣向外生長，融合約60%時傳代。免疫組化鑒定符合HSC的特征。傳至第3～5代用于實驗。使用TGF-β1刺激HSC使HSC活化，后加入等體積的PBS緩沖液。

3 質(zhì)粒構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染 標(biāo)準(zhǔn)長度的CTRP3互補DNA 克隆于pc DNA3.1載體中（吉凱基因，中國上海）。使用陽離子脂質(zhì)體對大鼠肝星形細胞系HSC-T6（上海細胞庫提供）進行轉(zhuǎn)染，對照組轉(zhuǎn)染空白載體，使用方法遵循廠家說明書。CTRP3的轉(zhuǎn)染效率由實時定量PCR 及免疫印跡法測定。

4 細胞增殖測定 MTT 測定細胞增殖，轉(zhuǎn)染后的HSC-T6細胞種植于96孔平板，放置24 h。MMT溶液加入每個孔中并另外培育4 h。移除上清液，晶體溶解于150μl二甲基亞砜中。酶標(biāo)儀測量其在490 nm 的吸收度。

5 細胞遷移測定 遷移轉(zhuǎn)膜小室測定細胞遷移率，將轉(zhuǎn)染的HSC-T6 細胞加入到上層小室，下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。5% CO2、37 ℃下孵育24 h后，移除上層未遷移細胞。下層已遷移的細胞用100%甲醇固定，然后在20%甲醇中以1%紫羅蘭晶體著色20 min。每個孔取6個隨機區(qū)域，用光學(xué)顯微鏡計算遷移到濾器底部的細胞數(shù)目。

6 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（q RT-PCR） 提取肝組織及HSC中的總RNA，取2μg反轉(zhuǎn)錄。按廠家說明書操作，完成RT-PCR 測定。引物如下:forward 5'-CGATTCACAGCCCCAGTCTC-3'，reverse 5'-GTGCAGGCTGGCAGAAAAC-3'；β-actin，forward 5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，reverse 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

7 免疫印跡（Western blotting） 2%聚丙烯酰胺凝膠電泳均等分蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜?；旌?%脫脂牛奶緩沖液、0.1%脫脂緩沖液，室溫下1 h，加入一抗（CTRP3，膠原蛋白I，α-SMA，p-Smad3，GAPDH）4℃過夜后，再加入二抗，室溫下1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑增加免疫條帶的顯像效果。圖像軟件測定光密度信號。

8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表達，兩組間比較使用t檢驗，多組之間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CTRP3在肝纖維化組織及活化HSC 中的表達 纖維化組患者HSC 中CTRP3在m RNA 水平的表達顯著低于正常組（圖1A）。在活化的HSC 中CTRP3無論在mRNA 水平還是蛋白水平均顯著下調(diào)（圖1B、C）。

圖1 CTRP3在肝纖維化組織和活化HSC中的表達

2 CTRP3過表達抑制HSC 增殖和遷移 為了研究CTRP3對HSC增殖和遷移的影響效果，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使HSC-T6 細胞過表達CTRP3 蛋白，進而檢測細胞增殖和遷移的變化。結(jié)果證實，肝纖維化組與正常肝組織組相比，CTRP3的過度表達引起了CTRP3在m RNA 水平和蛋白水平顯著增加（圖2A、B）。然后，又檢測了CTRP3 對HSC-T6 細胞遷移的效果（圖2C），增殖實驗證實TGF-β1顯著促進了HSCT6細胞的增殖。然而，與之相比，CTRP3的過表達更明顯抑制了HSC-T6細胞的增殖。此外，遷移實驗表明CTRP3過表達顯著抑制了由TGF-β1激活的HSCT6的遷移數(shù)目（圖2D）。

3 CTRP3 過表達抑制HSC 中細胞外基質(zhì)（ECM）的表達 我們檢測了CTRP3對HSC 中細胞外基質(zhì)的表達情況（圖3）。TGF-β1刺激后，HSC 中I型膠原和α-SMA 的蛋白表達水平顯著提高，過表達CTRP3的HSC 中，I型膠原和α-SMA 的蛋白表達水平顯著降低。

4 CTRP3過表達抑制了HSC 中TGF-β1／Smad通路的活化 TGF-β1／Smad信號通路在肝纖維化進程中至關(guān)重要。因此，為了進一步明確HSC 活化被抑制的分子機制，我們用免疫印跡法檢測了CTRP3 對Smad3磷酸化水平的影響（圖4）。TGF-β1 刺激后HSC中Smad3 的磷酸化表達水平顯著提高，過表達CTRP3的HSC中，Smad3的磷酸化水平顯著下降。

圖2 CTRP3過度表達抑制HSC的增殖和遷移

圖3 CTRP3過度表達抑制了HSC中的細胞外基質(zhì)表達

圖4 CTRP3的過表達抑制了HSC中TGF-β1／Smad通路的活化

討 論

本研究中我們第一次證實了CTRP3在肝纖維化組織和活化的HSC中低表達。CTRP3的過度表達不僅抑制了HSC的增殖和遷移，也抑制了TGF-β1激活的HSC-T6 中細胞外基質(zhì)的表達。進一步表明，在TGF-β1激活 的HSC-T6 中，CTRP3 的 過 度 表 達 極 大地抑制了Smad3的磷酸化水平。

CTRP3在纖維化進程中有重要作用。Wu等［11］報道，CTRP3的表達在心梗發(fā)生后明顯下降。類似地在本研究中，我們觀察到CTRP3在肝纖維化組織和活化的HSC中低表達。數(shù)據(jù)表明CTRP3可能在肝纖維化進程中至關(guān)重要。

眾多研究已經(jīng)證實，HSC 的增殖和遷移是肝纖維化進程的中心事件，TGF-β1被認(rèn)為是HSC 增殖和遷移的主要刺激因子［12-13］。此外，有報道稱TGF-β1的表達水平可以在肝纖維化組織中明顯上調(diào)，并且與肝纖維化的程度密切相關(guān)［14］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，TGFβ1的干預(yù)可以明顯促進HSC 的增殖和遷移。然而，CTRP3的過表達則可以明顯抑制這種增殖和遷移，CTRP3通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)HSC 的增殖和遷移可以減弱肝纖維化進展。

肝纖維化以細胞外基質(zhì)的過度合成為特征。α-SMA 在肝組織中的表達預(yù)示著HSC 的活化，被認(rèn)為在肝纖維化中至關(guān)重要［15］。此外，TGF-β1 可以誘導(dǎo)HSC活化產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)成分，比如膠原蛋白I和α-SMA［16］。我們也觀察到了TGF-β1顯著增加了膠原蛋白I和α-SMA 的蛋白表達水平。但是，CTRP3的過度表達卻極大的抑制了上述表達水平，CTRP3可能通過抑制HSC中細胞外基質(zhì)的生成而阻止肝纖維化。

TGF-β1／Smad信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中 至 關(guān) 重 要［17-18］。纖 維 化 進 程 中，TGF-β1 通 過 與TGF-β1受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，Smad2／3磷酸化后與Smad4結(jié)合形成多聚體，此Smad復(fù)合物移動至細胞核并調(diào)控靶基因的表達，比如膠原蛋白I和α-SMA［19］。Smad3可致病，敲除了Smad3的裸鼠避免了被二甲基亞硝銨誘導(dǎo)的肝纖維化［20］，有實驗證明敲除了Smad3后可以明顯抑制膠原蛋白I的表達并阻止成纖維細胞上皮化［21］。本研究證實CTRP3的過度表達極大的抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細胞中的Smad3的磷酸化表達水平。上述結(jié)果表明，CTRP3 通過抑制TGF-β1／Smad信號通路，至少部分減弱了肝纖維化。

總之，本研究證實了CTRP3抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖和遷移，并通過抑制TGF-β1／Smad信號通路，至少部分減弱了肝纖維化。這些發(fā)現(xiàn)表明，CTRP3有希望成為未來肝纖維治療的新靶點。