超臨界CO2發(fā)泡法制備聚己內(nèi)酯組織工程支架*

魏 煒，孫 東，劉鳳霞，許曉飛，劉志軍

(大連理工大學(xué) 化工學(xué)院， 遼寧 大連 116024)

0 引 言

組織工程學(xué)的原理是利用細(xì)胞和支架的結(jié)合，對(duì)病損組織器官進(jìn)行修復(fù)、重建，甚至永久替代，實(shí)現(xiàn)病損部位的修復(fù)[1]。其中支架為細(xì)胞提供生長(zhǎng)的場(chǎng)所，引導(dǎo)和控制組織生長(zhǎng)[2]，其應(yīng)具有生物相容性、三維多孔結(jié)構(gòu)、較高的機(jī)械強(qiáng)度、友好的材料細(xì)胞界面和可降解性等特征[3]。目前，聚己內(nèi)酯(PCL)是多孔支架中應(yīng)用較廣的材料，PCL是一種半結(jié)晶，生物相容和可生物降解的脂族聚酯，其在生理?xiàng)l件下具有約兩年的降解時(shí)間，并且它的疏水性可促進(jìn)細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)。因此，PCL已經(jīng)引起了生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的極大興趣，已被FDA批準(zhǔn)用于特定的應(yīng)用，如藥物輸送系統(tǒng)，縫合線和粘連屏障[4-5]，將PCL制備成多孔支架材料在組織工程領(lǐng)域有著更廣泛的應(yīng)用前景。

目前，制備支架材料的方法有靜電紡絲法[6]、成孔劑析出法[7]、熔融成型/顆粒濾瀝[8]、相分離法[9]等，使用這些方法存在成孔劑和有機(jī)溶劑殘留，高溫下無(wú)法添加藥物等活性物質(zhì)的問(wèn)題，因此，多孔組織工程支架的制備方法有待于改進(jìn)。

最初使用CO2氣體作為發(fā)泡劑來(lái)制備組織工程支架。隨著SCF技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，超臨界CO2(SC-CO2) 因其良好的擴(kuò)散性、溫和的操作條件、實(shí)驗(yàn)條件易控制等優(yōu)點(diǎn)，逐漸取代了氣態(tài)CO2制備技術(shù)。在此工藝中，首先SC-CO2溶解擴(kuò)散進(jìn)入聚合物中，隨后泄壓導(dǎo)致系統(tǒng)熱力學(xué)不平衡，SC-CO2相變形成氣核并在基質(zhì)里生長(zhǎng)，當(dāng)CO2逃逸出聚合物后留下泡孔[10]，最終得到具有良好連通性的多孔結(jié)構(gòu)。SC-CO2是綠色無(wú)污染的，且可避免高溫操作。國(guó)內(nèi)外專家對(duì)其不斷進(jìn)行研究，形成了許多衍生工藝[11-13]。但總的說(shuō)來(lái)，發(fā)泡工藝的研究和應(yīng)用還處于探索階段。

本文使用SC-CO2發(fā)泡制備PCL組織工程支架，系統(tǒng)考察PCL的分子量、發(fā)泡壓力和溫度等因素對(duì)支架泡孔形成的影響規(guī)律，以期達(dá)到對(duì)泡孔在連續(xù)尺寸范圍內(nèi)的制備。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及設(shè)備

PCL，相對(duì)分子質(zhì)量為60 kDa和240 kDa，醫(yī)用級(jí)，購(gòu)自深圳光華偉業(yè)實(shí)業(yè)有限公司，白色粒狀固體；二氧化碳(CO2)，食品級(jí)，純度>99.9%，購(gòu)自大連氣體有限公司。

超臨界反應(yīng)釜，威海市行雨化工試驗(yàn)器械有限公司；XLB-平板硫化機(jī)，青島錦九洲橡膠機(jī)械有限公司；GL447-2.8/8-400隔膜式壓縮機(jī)，北京匯知機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司；QUANTA 450掃描電子顯微鏡(SEM)，美國(guó)FEI公司；Auto Pore IV 9500壓汞儀，美國(guó)Micromeritics公司；FTC-質(zhì)構(gòu)儀TMS-PRO，美國(guó)FTC公司；圖像處理分析軟件Image Pro Plus 5.0，美國(guó)Media Cybernetics公司。

1.2 多孔支架制備

取一定質(zhì)量的PCL球狀顆粒，利用平板硫化機(jī)在5 MPa和60 ℃的條件下保壓10 min形成長(zhǎng)方形薄片。超臨界發(fā)泡實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。實(shí)驗(yàn)流程如下：將PCL矩形薄片置于高壓釜中，CO2由鋼瓶進(jìn)入壓縮機(jī)加壓，然后進(jìn)入反應(yīng)釜與PCL薄片接觸。釜內(nèi)的溫度由電加熱套加熱控制，壓力由壓縮機(jī)和閥門(mén)調(diào)節(jié)。待CO2在PCL中飽和后，打開(kāi)高壓釜下游的出口閥泄壓，最后取出發(fā)泡樣品進(jìn)行表征。

圖1 SC-CO2發(fā)泡實(shí)驗(yàn)裝置Fig 1 SC-CO2 foaming experimental device

1.3 孔結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 平均孔徑及孔徑分布

將樣品浸入液氮(-196 ℃)中10 min，然后淬斷以獲得適合做SEM的表面，使用導(dǎo)電膠帶固定，噴金處理60 s后，置于掃描電子顯微鏡QUANTA 450下觀察。用Image Pro Plus 5.0(IPP)軟件分析SEM圖像得到支架的平均孔徑和孔徑分布數(shù)據(jù)，通過(guò)IPP中的算法計(jì)算平均孔徑，對(duì)于每個(gè)樣品，至少統(tǒng)計(jì)了分布在整個(gè)截面上的50個(gè)孔。標(biāo)記為D的孔的平均直徑使用式(1)計(jì)算

(1)

1.3.2 孔隙率

本文利用比重瓶通過(guò)排水法間接測(cè)出樣品的體積，計(jì)算出發(fā)泡前PCL 壓片的密度ρs和發(fā)泡后PCL多孔材料的密度ρb，由式(2)可得到支架的孔隙率

φT=1-ρb/ρs

(2)

1.3.3 力學(xué)性能

利用TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試材料的力學(xué)性能。壓縮試驗(yàn)前需制備出具有合適尺寸的樣品，再以合適的速度進(jìn)行壓縮，得到力(F)與厚度變化(ΔL)的數(shù)據(jù)。利用式(3)和(4)計(jì)算得到應(yīng)力和應(yīng)變曲線，進(jìn)而可計(jì)算出材料的彈性模量。

Stress=F/A

(3)

Strain=ΔL/L

(4)

式中，A為橫截面積。

2 結(jié)果與討論

本文利用SC-CO2與聚合物之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)多孔支架泡制備。其中，聚合物的性質(zhì)，壓力、保壓時(shí)間、溫度以及泄壓速率是影響SC-CO2發(fā)泡法制備多孔支架的重要因素，本文考察了以上因素對(duì)PCL基質(zhì)發(fā)泡過(guò)程的影響規(guī)律。

2.1 PCL分子量對(duì)發(fā)泡的影響

在研究分子量對(duì)泡孔形成的影響時(shí)，選用5，8，10，12，60 和240 kDa分子量的PCL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？疾斓臈l件為：原料片厚度0.83 mm，溫度45，壓力25 MPa，保壓時(shí)間2 h，泄壓速率0.14 MPa/s。結(jié)果如圖2(f)所示，聚合物分子量為240 kDa時(shí)，支架的平均孔徑較小，并且孔徑分布在較窄區(qū)間內(nèi)，當(dāng)分子量為5～12 kDa時(shí)，形成了較大的泡孔且孔壁較薄，此時(shí)聚合物在SC-CO2中容易呈熔融態(tài)，發(fā)泡過(guò)程中易于成孔[14]。聚合物分子量越大，其粘度就越高，泄壓引起的成核及泡孔生長(zhǎng)過(guò)程中，大分子量聚合物會(huì)抑制CO2釋放，小分子量聚合物中的CO2則容易釋放，因此，在泄壓時(shí)分子量低的PCL中氣核生長(zhǎng)較快，容易形成孔大且壁薄的支架[15]。

圖2 不同分子量PCL支架的SEM圖像Fig 2 SEM images for PCL scaffolds with different kinds of molecular weight

2.2 過(guò)程參數(shù)對(duì)發(fā)泡的影響

CO2在PCL中的溶解度、PCL熔融時(shí)的粘度、CO2成核密度以及擴(kuò)散速率與過(guò)程參數(shù)有著密切的關(guān)系[16-17]，SC-CO2發(fā)泡實(shí)驗(yàn)的主要參數(shù)包括壓力、保壓時(shí)間、溫度以及泄壓速率，通過(guò)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置實(shí)現(xiàn)對(duì)泡孔尺寸和形貌的控制。選用60 kDa的PCL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究各參數(shù)對(duì)PCL發(fā)泡過(guò)程的影響。

2.2.1 操作壓力

實(shí)驗(yàn)壓力主要影響SC-CO2密度，從而影響其在PCL中的溶解，進(jìn)而影響之后泡孔的形成。在溫度45 ℃，泄壓速率0.14 MPa/s，不同壓力作用下支架的SEM照片和平均孔徑隨壓力的變化分別如圖3和圖4所示。結(jié)果表明，壓力升高時(shí)，支架平均孔徑和孔隙率逐漸減小，而泡孔密度呈增大的趨勢(shì)。壓力越高，CO2的擴(kuò)散系數(shù)和在PCL基質(zhì)中溶解度越大，泄壓時(shí)產(chǎn)生的過(guò)飽和度較高，成核密度變大[18]。根據(jù)均相成核理論，體系壓力降低越多，CO2形成氣核的能壘就越低，因此在PCL基質(zhì)中形成的氣核就越多[19]。

圖3 在不同壓力條件下制備的PCL支架的SEM圖像Fig 3 SEM images for PCL scaffolds fabricated at different pressure

圖4 在不同壓力條件下制備的PCL支架的孔隙率和平均孔徑Fig 4 Porosity and mean pore diameters of PCL scaffolds fabricated at different pressure

2.2.2 保壓時(shí)間

PCL在SC-CO2中的溶解過(guò)程，需要一定時(shí)間才能夠達(dá)到溶解平衡。因此，保壓時(shí)間對(duì)于泡孔的形成起到的一定的影響。在實(shí)驗(yàn)溫度為45 ℃，壓力25 MPa，泄壓速率0.14 MPa/s的條件下，考察保壓時(shí)間對(duì)于泡孔的影響規(guī)律，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示，隨著發(fā)泡時(shí)間從2 h增加至5 h，孔徑和孔隙率隨時(shí)間無(wú)顯著變化，表明在2 h的保壓時(shí)間內(nèi)，CO2在PCL原料片中已接近溶解平衡，并且所有樣品均呈現(xiàn)出均勻的孔徑和高孔隙率?？紤]這些結(jié)果，決定使用2 h進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 操作溫度

溫度會(huì)影響PCL熔體粘度，因此研究了壓力25 MPa，保壓2 h和泄壓速率0.14 MPa/s條件下，支架性能隨溫度的變化情況，支架截面SEM照片如圖7所示，平均孔徑變化如圖8所示。如圖7所示，隨著溫度的升高，平均孔徑增大，孔密集程度增大，當(dāng)操作溫度為50℃時(shí)，孔徑達(dá)到最大值，之后泡孔呈減小趨勢(shì)。PCL熔體在50℃時(shí)的粘度比在40 ℃時(shí)小，因此隨著溫度的升高，泡孔生長(zhǎng)阻力降低，因此孔徑變大，但是當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，PCL熔體的粘度變小，因此熔化變軟而不能支持大孔的形成，并且在聚合物基質(zhì)玻璃化之前孔壁容易破裂[20]，結(jié)果，PCL的孔徑減小，并且孔壁出現(xiàn)明顯的塌縮，聚并成如圖7(e)所示的支架形貌。

圖5 不同保壓時(shí)間下制備的PCL支架的SEM圖像Fig 5 SEM images for PCL scaffolds fabricated at different time

圖6 不同保壓時(shí)間下PCL支架平均孔徑和孔隙率Fig 6 Mean pore diameters and porosity of PCL scaffolds fabricated at different time

圖7 在不同溫度條件下制備的PCL支架的SEM圖像Fig 7 SEM images for PCL scaffolds fabricated at different temperatures

圖8 在不同溫度條件下制備的PCL支架的平均孔徑Fig 8 Meanpore diameters of PCL scaffolds fabricated at different temperatures

2.2.4 泄壓速率

泄壓速率對(duì)泡孔的形成也起到重要作用，在45 ℃，25 MPa和保壓2 h的情況下，調(diào)節(jié)泄壓速率來(lái)研究泡孔的形成規(guī)律，結(jié)果如圖9所示。從掃描電鏡照片可以看出，低泄壓速率導(dǎo)致形成大的泡孔結(jié)構(gòu)，并且孔徑分布范圍寬，這是因?yàn)镃O2濃度梯度小，成核速度放慢，泡孔的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，泡孔由于CO2的擴(kuò)散先生長(zhǎng)進(jìn)后聚并，導(dǎo)致形成較大孔徑和寬孔徑分布的支架結(jié)構(gòu)。高泄壓速率時(shí)，PCL內(nèi)CO2濃度梯度大，成核數(shù)目多且聚合物固化快，形成孔徑較為均勻的泡孔[21]。

圖9 在不同降壓速率條件下制備的PCL支架SEM圖像Fig 9 SEM images for PCL scaffolds fabricated at different depressurization rates

2.3 支架的力學(xué)性能

通過(guò)壓縮試驗(yàn)表征獲得的具有良好形態(tài)的PCL支架的力學(xué)性能。圖10顯示了在45 ℃和25 MPa下制備的支架的壓縮載荷-位移曲線，PCL支架的彈性模量及孔徑和孔隙率部分?jǐn)?shù)據(jù)如表1所示。多孔材料的彈性模量及孔隙率均與支架形態(tài)高度相關(guān)，表中大孔結(jié)構(gòu)的支架擁有高孔隙率，由圖11也可知，隨著泡孔孔徑的增大，支架孔隙率增加，而力學(xué)性能減弱，泡孔孔徑大時(shí)，孔壁薄(如圖9(b)所示)，因此對(duì)應(yīng)的機(jī)械強(qiáng)度較弱;在45 ℃，25 MPa(圖9(c))或者 55 ℃，25 MPa(圖7(e))條件下，實(shí)驗(yàn)得到具有較小孔徑和較厚孔壁的支架，孔隙在PCL內(nèi)占比較小，因此具有低孔隙率和較高的力學(xué)性能。由表1可見(jiàn)，大孔材料的彈性模量>10 MPa，與其他方法制得的三維多孔PCL支架的力學(xué)性能(E=14.9±0.6 MPa)相近[22]，其孔隙率在90%左右，符合組織工程支架的應(yīng)用要求。

圖10 PCL支架的壓縮載荷-位移曲線Fig 10 Compressive load-displacement curve of PCL scaffold

表1在不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的PCL支架的孔隙率、平均孔徑和彈性模量

Table1Porosity,meanporediameterandelasticmodulusofPCLscaffoldsfabricatedatdifferentexperimentalconditions

溫度/℃壓力/MPa孔隙率/%平均孔徑/μm彈性模量/MPa45159461113.845208849017.045258441220.150259052017.355258338620.5

圖11 彈性模量和孔隙率與孔徑的關(guān)系Fig 11 Elastic modulus and porosity versus pore diameter

3 結(jié) 論

通過(guò)SC-CO2發(fā)泡制備了具有特定孔尺寸的PCL多孔支架。高壓下PCL能溶解更多的CO2而形成較小孔徑的PCL支架。保壓時(shí)間可影響CO2在PCL基質(zhì)中的溶解平衡，從而影響泡孔孔徑及密度。溫度影響聚合物的粘度，從而影響CO2的擴(kuò)散，最終決定了支架的形態(tài)。泄壓速率越慢，泡孔生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，形成孔徑分布范圍寬且孔徑較大的多孔支架。泡孔結(jié)構(gòu)的不同影響多孔支架的性質(zhì)，得到不同的孔隙率及機(jī)械強(qiáng)度。本文制備的彈性模量>10 MPa以及在132～450 μm孔徑范圍內(nèi)的支架材料有望應(yīng)用于組織工程修復(fù)。實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)適當(dāng)選擇SC-CO2發(fā)泡條件，可以制備出形態(tài)及力學(xué)性能可控的組織工程PCL多孔支架。