4種天然溫石棉致大鼠肺損傷及對HO-1和HSP-70的影響

陳建國，黃柳雯，李 杰，崔 琰，霍婷婷，鄧建軍，孫耀川，張青碧

(1.西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，四川瀘州 646000;2.瀘州市疾病預(yù)防控制中心，四川瀘州 646000;3.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000;4.瀘州市衛(wèi)生健康委員會，四川瀘州 646000;5.西南科技大學(xué)，四川綿陽 621010;6.四川綿陽四〇四醫(yī)院，四川綿陽 621000;7.西南交通大學(xué)地球科學(xué)環(huán)境工程學(xué)院，四川成都 611756)

石棉是性能優(yōu)異的纖維狀硅酸鹽礦物質(zhì)，可分為溫石棉和角閃石石棉。隨著應(yīng)用的深入，人類漸漸意識到石棉纖維對人體健康有不良影響，可致肺纖維化、肺癌、胸膜間皮瘤、胸膜斑等(施海燕等，2009)。國際癌癥研究組織(IARC)已宣布石棉是一類致癌物質(zhì)(Andersen et al.，2002)，但溫石棉的使用安全性仍然存在較大爭議(楊方明，2002)。中國雖已在2002年淘汰了角閃石石棉，卻仍是全球溫石棉最大消費(fèi)國和第二大生產(chǎn)商(Courtice et al.，2012;Wang X et al.，2013)，其中甘肅阿克塞、青海茫崖、四川新康、陜西陜南是我國溫石棉的主要產(chǎn)地，有超過一百萬人職業(yè)暴露于溫石棉環(huán)境下。目前，溫石棉導(dǎo)致肺部損傷的機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及基因突變等方面。血紅素氧化合酶1(HO-1)具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗氣道平滑肌細(xì)胞增殖等重要功能(Wagener et al.，2001;Song et al.，2002)，細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白70(HSP-70)具有抗凋亡、抗炎作用(Song et al.，2008)。有研究表明顆粒物或較短纖維對肺部的損傷與HO-1和HSP-70有關(guān)(Farina et al.，2011;Obata et al.，2011;Sancini et al.，2014;Yoshiura et al.，2015)。本研究以我國甘肅阿克塞、青海茫崖、四川新康、陜西陜南四大礦區(qū)的天然溫石棉為研究對象，用掃描電子顯微鏡、紅外光譜和X射線熒光光譜分析粉塵形貌、表面活性基團(tuán)和化學(xué)組分，并對Wistar大鼠進(jìn)行多次非暴露式氣管滴注染毒，觀察各時間點大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)和總蛋白(TP)含量的變化，以及肺組織中HO-1、HSP-70 mRNA和HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)量的變化，為探討溫石棉致大鼠肺部損傷及其可能的機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要儀器有7200型分光光度計(優(yōu)尼柯上海儀器公司，F(xiàn)J7200)、酶標(biāo)儀(thermo Multiskan Spectrum)、臥式行星球磨機(jī)(QM-3SP4J，南京大學(xué)儀器廠)、冷凍離心機(jī)(eppendorf，5810R)、掃描電子顯微鏡(Libra 200FE，德國蔡司公司)、紅外光譜儀(Spectrum One，美國PE儀器公司)、X射線熒光光譜儀(PW1404，Philips)、DNA/RNA測定儀(Nano-Drop 1000，日本 Olympus公司)和 96孔 PCR儀(ABI7900HT，Life technologies公司)。

主要試劑有乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、總蛋白(TP)檢測試劑盒(南京建成生物制品研究所)，Trizol試劑提取盒(北京天根生化科技有限公司)，PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑(Takara公司)，BCA蛋白定量試劑盒(巴傲得生物科技有限公司)，兔抗大鼠 HO-1多克隆抗體(英國 Abcam公司)，兔抗大鼠HSP-70多克隆抗體(美國Cell Signaling Techology公司)，β-actin小鼠單克隆抗體(北京柏奧易杰科技有限公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(北京柏奧易杰科技有限公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京柏奧易杰科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備及特性分析

受試物為我國甘肅阿克塞、青海茫崖、四川新康、陜西陜南四大礦區(qū)的天然溫石棉。將4種礦石用高速粉碎機(jī)初步粉碎2～3 min，然后用行星球磨機(jī)濕磨阿克塞溫石棉30 h、茫崖溫石棉18 h、新康溫石棉24 h、陜南溫石棉30 h，收集礦漿，置于150℃烘箱內(nèi)烘烤2 h，磨碎備用。采用掃描電子顯微鏡觀察礦物粉塵形貌;紅外光譜儀分析研磨后的礦物粉塵表面活性基團(tuán)，掃譜范圍4 000～400 cm-1;X射線熒光光譜儀分析礦物粉塵的主要化學(xué)組分和微量元素。

1.2.2 實驗動物與分組

選用的初斷乳、4～6周齡、體重180～220 g的SPF級Wistar大鼠雄鼠共90只，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動物倫理審查委員會同意，合格證號201601011)，隨機(jī)分為5組即阿克塞、茫崖、新康、陜南溫石棉組和陰性對照組(生理鹽水)，每組18只，分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2.3 實驗動物染毒與取材

稱取0.02 g消毒溫石棉粉體，加入生理鹽水和青霉素鈉(8 000 U/mL)，制備成濃度2.0 mg/mL的溫石棉懸液，用前超聲處理30 min。采用非暴露式氣管滴注法染毒大鼠，每次0.5 mL，每月1次。陰性對照用生理鹽水。滴注后自由飲水、進(jìn)食。分別在滴注1、6、12個月時各取材6只，迅速取出肺組織稱量，用EP管分裝置 -80℃冰箱保存?zhèn)溆?。生理鹽水反復(fù)灌洗右肺3次后收集灌洗液(回收率80%以上)于離心管中即為支氣管肺泡灌洗液(BALF)。

1.2.4 大鼠BALF中LDH、AKP和TP的測定

BALF中LDH、AKP和TP的含量分別采用2，4-二硝基苯肼比色法、分光光度法、考馬斯亮藍(lán)法測定，實驗步驟按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作，觀察我國四大礦區(qū)天然溫石棉對大鼠肺損傷作用。

1.2.5 大鼠肺組織HO-1、HSP-70 mRNA的表達(dá)

取肺組織，TRIzol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR擴(kuò)增。實驗步驟按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作。HO-1、HSP-70和β-actin mRNA引物序列見表1。

表1 HO-1、HSP-70及β-actin mRNA引物序列Table 1 Gene primer sequences of HO-1，HSP-70 and β-actin

1.2.6 大鼠肺組織HO-1、HSP-70蛋白的表達(dá)

將肺組織放入研缽中研磨，加入蛋白抽提試劑和蛋白酶抑制劑，提取蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，本實驗采用濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式，電流130 mA，電壓60 V左右，時間為60 min。小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉 1 h，將 HO-1 一抗(1∶1 000)、HSP-70 一抗(1∶1 000)、β-actin 一抗(1∶5 000)用封閉液稀釋，將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃孵育過夜，次日用TBST洗膜3次，后加入二抗，室溫反應(yīng)1 h，再用TBST洗膜3次。將上述PVDF膜置于ECL顯影液中，采集圖像，ImageJ軟件掃描讀取蛋白條帶的灰度值并分析，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料若服從正態(tài)分布，用x±s描述;若方差齊采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計推斷，兩兩比較用SNK-q法檢驗，否則采用Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 測試與結(jié)果

2.1 樣品形貌

圖1 我國四大礦區(qū)天然溫石棉樣品形貌Fig.1 A photo of four natural chrysotile asbestos samples from major mining areas in China

圖1分別為阿克塞溫石棉原樣(A)與濕磨30 h后制備的礦物粉體(a)、茫崖溫石棉原樣(B)與濕磨18 h后制備的礦物粉體(b)、新康溫石棉原樣(C)與濕磨24 h后制備的礦物粉體(c)、陜南溫石棉原樣(D)與濕磨30 h后制備的礦物粉體(d)的自然光下照片。濕磨后的礦物粉體保存?zhèn)溆糜诤罄m(xù)體內(nèi)滴注。

2.2 粉體顯微形貌分析

掃描電鏡圖像顯示，4種溫石棉粉塵的顯微形態(tài)類似，均為纖維狀，并摻雜有少量其他塊狀礦物。阿克塞溫石棉為長纖維，形態(tài)較一致;茫崖溫石棉為更細(xì)長的纖維，并與小而薄的塊狀結(jié)構(gòu)混合;新康溫石棉有團(tuán)聚現(xiàn)象;陜南溫石棉相對較短并且混合了薄塊狀結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.3 粉體紅外光譜分析

如圖3所示，我國四大礦區(qū)天然溫石棉樣品在各自3個研磨時間段后的紅外光譜圖吸收峰的峰位峰形基本相同。4種溫石棉FTIR圖譜共同顯示，1 622和1 618 cm-1附近的吸收帶轉(zhuǎn)移到了更高的波數(shù)。3 695～3 650 cm-1附近的吸收譜帶是—OH的吸收峰，主要由內(nèi)外—OH伸縮振動引起;1 050～950 cm-1附近的吸收譜帶主要由Si—O伸縮振動引起;650～600 cm-1附近的吸收譜帶主要由Mg—O伸縮振動引起。新康溫石棉1 630和1 455 cm-1附近的吸收帶發(fā)生了偏移。因為紅外光譜對陽離子的質(zhì)量和電價敏感，—OH伸縮振動頻率受到具有—OH配位的八面體陽離子的影響，導(dǎo)致了在低波數(shù)方向上的分裂和移動。阿克塞和陜南溫石棉1 060 cm-1附近的Si—O伸縮振動帶吸收分裂與新康溫石棉相比有差異，表明這兩種溫石棉的晶體結(jié)構(gòu)比茫崖和新康更完整。通過上述分析，初步確定4種石棉樣品是溫石棉，且經(jīng)不同時間研磨后，其結(jié)晶度和化學(xué)活性基團(tuán)未明顯改變。

圖2 我國四大礦區(qū)天然溫石棉礦物粉體的電鏡掃描圖片F(xiàn)ig.2 Scanning electron microscope images of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China

圖3 我國四大礦區(qū)天然溫石棉不同研磨時間后礦物粉體的FTIR分析Fig.3 The FTIR analyses of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China at different grinding time spans

2.4 常量化學(xué)成分檢測

我國四大礦區(qū)天然溫石棉常量化學(xué)成分相似(表2)，主要由 SiO2和 MgO組成，還含有少量的Fe2O3、Al2O3。茫崖和新康溫石棉SiO2含量高于阿克塞和陜南溫石棉，并且含較多Al2O3和Fe2O3。陜南溫石棉中SiO2含量最低，MgO含量最高。

2.5 微量元素檢測

表2顯示，我國四大礦區(qū)天然溫石棉礦物粉體的微量元素相似，主要含有 Cr、Ni、Mn、Ti和 P 等元素。阿克塞和茫崖溫石棉含有較多的Cr和Ni，陜南溫石棉含有較多的Mn，新康溫石棉含有較多的P、Ti和Zr。

表2 我國四大礦區(qū)天然溫石棉礦物粉體的主量(w B/%)和微量(w B/10-6)元素含量Table 2 Main chemical composition analysis(w B/%)and trace chemical element conteat(w B/10-6)of four natural chrysotile asbestos in major mining areas in China

2.6 溫石棉染毒大鼠BALF中LDH、AKP和TP含量的變化

表3顯示，染毒1個月時，與陰性對照組比較，阿克塞、茫崖和新康溫石棉組BALF中LDH增高(P＜0.05)，各溫石棉組 AKP和 TP含量增高(P＜0.05)，且茫崖溫石棉組LDH高于其余溫石棉組(P＜0.05)，新康溫石棉組LDH高于陜南溫石棉組(P＜0.05)，茫崖溫石棉組AKP高于其余溫石棉組(P＜0.05)，阿克塞、茫崖和新康溫石棉組TP高于陜南溫石棉組(P＜0.05);染毒6個月和12個月時，與陰性對照組比較，各溫石棉組LDH、AKP和TP含量均增高，且溫石棉組兩兩之間比較均有差異(P＜0.05)，茫崖和新康溫石棉組高于阿克塞和陜南溫石棉組(P＜0.05)。阿克塞、茫崖和新康溫石棉組的LDH以及各溫石棉組AKP、TP含量都隨著染毒時間延長呈上升趨勢(P＜0.05)。

2.7 HO-1、HSP-70的mRNA和蛋白表達(dá)水平

染毒1個月時，與陰性對照組比較，各溫石棉組大鼠肺組織中HO-1、HSP-70 mRNA以及HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)水平均增高(P＜0.05)，且溫石棉組兩兩之間比較無差異(P＞0.05);染毒6個月時，與陰性對照組比較，各溫石棉組增高，且阿克塞和陜南溫石棉組低于茫崖和新康溫石棉組(P＜0.05)。染毒12個月時，與陰性對照組比較，茫崖和新康溫石棉組降低，且阿克塞和陜南溫石棉組高于茫崖和新康溫石棉組(P＜0.05)(圖4)。

表3 我國四大礦區(qū)天然溫石棉對大鼠BALF中LDH、AKP和TP含量的影響(n=6，x±s)Table 3 Effects of four natural chrysotile asbestos in major mining areas of China on the content of lactate dehydrogenase，alkaline phosphatase and total protein in alveolar lavage fluid of rats(n=6，x±s)

圖4 我國四大礦區(qū)天然溫石棉對大鼠肺組織HO-1、HSP-70的蛋白和mRNA表達(dá)的影響(n=6，x±s)Fig.4 Effects of four natural chrysotile asbestos in major mining areas in China on the expression of HO-1 and HSP-70 protein and mRNA in rat lung tissue(n=6，x±s)

3 討論

BALF成分的變化可以較為敏感地反映肺對吸入毒物的反應(yīng)和肺受損程度。LDH屬胞漿酶，當(dāng)肺部組織受到損傷時，血液或組織液滲漏到肺泡可導(dǎo)致LDH漏出量增多，從而作為反映毒物毒性的早期靈敏指標(biāo)。AKP是一種常見的免疫標(biāo)志酶，中性粒細(xì)胞浸潤程度和肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損程度與AKP含量的改變呈正比關(guān)系;血漿滲出的蛋白質(zhì)是BALF中TP的主要來源，它能夠作為肺部血管通透性的指標(biāo)，肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷的程度可通過TP含量的變換來反映。本實驗結(jié)果顯示，阿克塞、茫崖和新康溫石棉組LDH以及各溫石棉組AKP和TP含量在各時間點高于陰性對照組且都隨著染毒時間延長呈上升趨勢。徐斌(2016)在探討細(xì)顆粒物PM2.5對人肺泡上皮細(xì)胞A549損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著染毒濃度和時間的增加，LDH含量增加，說明細(xì)顆粒物PM2.5對人肺泡上皮細(xì)胞A549的損傷可以引起LDH增加。Wang G等(2013)在探討臭氧和細(xì)顆粒物暴露對大鼠肺部影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，染毒3周后大鼠BALF中AKP和TP的含量與陰性對照組相比增加明顯，提示臭氧和細(xì)顆粒物聯(lián)合暴露會造成大鼠肺部損傷。在實驗中也發(fā)現(xiàn)隨著染毒時間的延長，我國不同礦區(qū)的4種溫石棉染毒組BALF中AKP和TP的含量增多。綜上，大鼠暴露于溫石棉后，BALF中LDH、AKP和TP含量發(fā)生了變化，這說明我國四大礦區(qū)天然溫石棉可導(dǎo)致大鼠肺部生化功能障礙，溫石棉進(jìn)入肺部后可通過改變中性粒細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性或使細(xì)胞受損，使各種細(xì)胞酶滲出增加，對肺組織具有毒性損傷作用，在一定程度上可導(dǎo)致大鼠肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷及肺部炎癥。

HO-1對多種呼吸系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用，HSP-70作為分子伴侶參與細(xì)胞調(diào)控和維持細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的正確構(gòu)象及功能，具有減輕肺損傷的生物學(xué)功能。我國四大礦區(qū)天然溫石棉可造成大鼠肺部損傷，那么對肺組織中HO-1和HSP-70表達(dá)有何影響?本實驗結(jié)果顯示，各溫石棉組在染毒1和6個月時大鼠肺組織 HO-1、HSP-70 mRNA和 HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)量與陰性對照組比顯著增高。有研究觀察到小鼠急性暴露于細(xì)顆粒物PM2.5后，肺組織中HO-1、HSP-70蛋白的表達(dá)量高于陰性對照組(Farina et al.，2011;Sancini et al.，2014)，大鼠氣管內(nèi)滴注TiO2納米粒子或石棉纖維后，大鼠肺部HO-1 mRNA和HO-1蛋白含量均增加(Obata et al.，2011;Yoshiura et al.，2015)，以上都提示顆粒物和纖維物質(zhì)造成肺部損傷可能與HO-1和HSP-70有關(guān)。而有研究報道肺組織中HO-1和HSP-70表達(dá)的減少意味著肺部生物轉(zhuǎn)化或解毒作用變緩慢(Beere et al.，2000;Li et al.，2005)，本研究結(jié)果顯示，青海茫崖和四川新康溫石棉組HO-1、HSP-70 mRNA和HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)量在染毒12個月時比陰性對照和阿克塞和陜南溫石棉組低。這可能是其對肺組織損傷作用較強(qiáng)引起解毒和修復(fù)作用緩慢導(dǎo)致的。由此推測，當(dāng)機(jī)體受到溫石棉纖維短時間刺激時，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)使HO-1、HSP-70保護(hù)性機(jī)制啟動，通過表達(dá)量增加來減輕細(xì)胞的損傷，但是長時間毒性較強(qiáng)的溫石棉刺激可能削弱了機(jī)體免疫監(jiān)視及清除功能，導(dǎo)致HO-1、HSP-70 mRNA和 HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)量下降。

Sporn(2011)和Hamra等(2017)發(fā)現(xiàn)肺組織的損傷與溫石棉纖維的結(jié)構(gòu)、尺寸大小和生物持久性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，我國四大礦區(qū)天然溫石棉礦物粉體大多排列成細(xì)長纖維束狀。Li和Fukagawa(2010)認(rèn)為溫石棉纖維可通過呼吸進(jìn)入肺內(nèi)，如不能排出，可被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬或穿透上皮細(xì)胞而進(jìn)入肺間質(zhì)，從而在體內(nèi)持續(xù)停留很長時間造成肺部損傷，提示溫石棉纖維可能對大鼠肺部造成不同程度的機(jī)械損傷。本研究采用的是未提純的4種天然溫石棉，X射線熒光光譜分析顯示阿克塞、茫崖、新康溫石棉主要含有SiO2和MgO，陜南溫石棉中的SiO2含量較低，MgO含量較高，雜質(zhì)含量不同可能是各溫石棉樣品成分不同的原因之一。Darne等(2016)通過微核實驗和彗星實驗證實了SiO2的遺傳毒性，提示溫石棉毒性強(qiáng)弱可能和SiO2含量有關(guān)。4種溫石棉成分對比顯示，陜西陜南溫石棉中MgO含量較高，SiO2含量較低，前期課題組XRD結(jié)果(Zeng et al.，2018)顯示陜南溫石棉中含水鎂石，這可能是其MgO含量較高的原因之一。孟麗娟等(2005)發(fā)現(xiàn)Mg可維護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性，對大鼠肺損傷有保護(hù)作用，提示Mg含量較高可能是陜西陜南溫石棉毒性較弱的原因。本研究中茫崖、新康溫石棉主要含有較多的Al2O3和Fe2O3。Huo等(2018)推測Al2O3可增強(qiáng)纖維的毒性，Toyokuni(2014)發(fā)現(xiàn)涂鐵石棉纖維能像鋒利的刀一樣使間皮細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鍵斷裂，巨噬細(xì)胞和間皮細(xì)胞里Fe2+的長期沉積能夠誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)致癌作用，它們均提示Al2O3和Fe2O3含量較高可能是茫崖、新康溫石棉毒性較高的原因。本研究微量元素檢測結(jié)果顯示，茫崖溫石棉含有最多的Cr、Ni，其次是阿克塞、新康和陜南溫石棉，四川新康溫石棉含有較多Ti。溫石棉中的微量元素可進(jìn)入肺部的弱酸環(huán)境并溶解，因此微量元素的局部濃度增加了生物毒性(Zeng et al.，2018)。有研究表明Cr、Ni等元素可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)(Scimeca et al.，2014;Cao et al.，2016;Halasova et al.，2016;Tomioka et al.，2016)，Sun 等(2012)發(fā)現(xiàn)小鼠暴露于TiO2納米粒子90天后發(fā)生了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激肺毒性反應(yīng)它們均提示較多的Cr、Ni和Ti微量元素可能是茫崖和新康溫石棉毒性較高的原因。

4 結(jié)論

(1)我國四大礦區(qū)天然溫石棉可引起B(yǎng)ALF中3種肺損傷指標(biāo)增加，對大鼠肺組織有毒性作用，可導(dǎo)致大鼠肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷以及肺部炎癥。

(2)長期染毒后，茫崖和新康溫石棉可引起大鼠體內(nèi) HO-1、HSP-70 mRNA和 HO-1、HSP-70蛋白表達(dá)量下降，導(dǎo)致大鼠肺部損傷。

(3)茫崖和新康溫石棉致大鼠肺損傷作用強(qiáng)于阿克塞和陜南溫石棉，作用強(qiáng)度差異的原因可能與其形態(tài)與雜質(zhì)含量有關(guān)。