黃山粉蠅DNA條形碼和形態(tài)鑒定*

聶國嬡 楊慶貴 何 江 胡雙雙 鄧耀華 孫立新**

(1. 江蘇省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，江蘇南京 210019; 2. 江蘇國際旅行衛(wèi)生保健中心， 江蘇南京 210019; 3. 上海浦東國際機場海關(guān)，上海 201202)

麗蠅科包含麗蠅、迷蠅、鼻蠅、金蠅和伏蠅5個亞科，約有1 100余種，我國約有250余種(范滋德，1992；師鑒等，2005)。麗蠅科分布廣泛，在干、濕、寒、熱環(huán)境中皆有分布，甚至在南、北極區(qū)或數(shù)千米的高寒山區(qū)也有分布記載。其中麗蠅亞科中的粉蠅族Polleniini已知11屬近100種，在我國已發(fā)現(xiàn)4屬28種，分布于全北區(qū)、東洋區(qū)及澳洲區(qū)(范滋德，1997；馮炎，2004)。作者2018年4月在對江蘇南京建鄴區(qū)進行蠅類監(jiān)測的過程中，捕獲粉蠅屬雄性成蠅2頭。

病媒生物種類的鑒定以傳統(tǒng)形態(tài)鑒定為主DNA條形碼(線粒體細胞色素c氧化酶I基因，COI)為輔。但對于獲得的卵、蛹、幼蟲或重要鑒別特征損壞的成蟲，DNA條形碼技術(shù)對其種類鑒定具有重要的參考意義。因此DNA條形碼數(shù)據(jù)庫越完善對于病媒生物種屬鑒定的參考價值越大。我國對粉蠅屬DNA條形碼的記錄有粗野粉蠅Polleniarudis、偽粗野粉蠅P.pediculata、匈牙利粉蠅P.hungarica、游蕩粉蠅P.vagabunda、長陽粉蠅P.labialis等(魏曉雅等，2016；楊慶貴等，2017；杜鵑等，2019)；其數(shù)量甚少。本文通過形態(tài)特征結(jié)合DNA條形碼鑒定結(jié)果，鑒定采獲蠅種為黃山粉蠅P.huangshanensisFanetChen, 1997。本研究補充了我國粉蠅屬DNA條形碼庫，且以往資料顯示江蘇省沒有該蠅類的相關(guān)紀(jì)錄，為該屬的區(qū)系及演化提供了重要的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本成蠅2頭，雄蟲，為2018年4月于南京建鄴區(qū)(北緯31°59'3"、東經(jīng)118°43'49")的灌木叢處捕獲。

1.2 儀器與試劑

體視顯微鏡(Stemi 2000)、Dneasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)DNA提取試劑、Axcel Advanced全自動核酸分析儀、QX DNA Size Marker 100～2 500 bp，Dneasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)，10×PCR buffer(無Mg2+)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、Taq DNA聚合酶(5 U / μL)(TaKaRa)。

1.3 形態(tài)特征鑒定

對該蠅種的體長、頭部、胸部、翅、足、腹部等形態(tài)特征進行觀察記錄(范滋德，1997)。

1.4 目的基因擴增

參照文獻(Folmeretal., 1994)設(shè)計COI 基因擴增通用引物: LCO1490：5′-G G T C A A C A A A T C A T A A A G A T A T T GG-3′；HCO2198：5′-T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T CA-3′。由南京銳真生物技術(shù)有限公司合成。用Dneasy Blood and Tissue Kit DNA提取試劑盒，按操作說明書要求提取蠅類的總DNA，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

在35 μL的體系中，10 × buffer 3.5 μL，10 μmol上下游引物各1.5 μL，dNTP 3 μL，DNA模板3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL(5 U/ μL)，滅菌去離子水補足至35 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Axcel Advanced全自動核酸分析儀檢測得到750 bp左右的明亮單一條帶的樣本送往南京銳真生物技術(shù)有限公司進行克隆測序。

圖1 蠅種形態(tài)特征圖(♂ )Fig.1 The morphological characteristics of the flies(♂ )A. 背面觀；B. 頭部；C. 尾器側(cè)面觀.A. Dosal view；B. Anterior view；C. Male genitalia, lateral view.

1.5 序列分析

所得序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor V 7.1.9.0軟件驗證圖譜為有效序列，根據(jù)峰圖質(zhì)量去掉兩端引物，將正反向測序結(jié)果進行拼接得到全長為658 bp的有效長度序列，用DnaSP 5.0計算捕獲蠅類COI的堿基組成。

將測定的序列在NCBI上通過BLAST程序進行序列同源性比較。用Mega 7軟件對得到的序列及在NCBI中選取與捕獲蠅類相似度較高的其他5種蠅種的COI基因片段，以家蠅為外群(表1)。采用鄰接法構(gòu)建捕獲蠅類的(Neighbor-Joining，NJ)聚類樹。

表1 捕獲蠅類及外群種類列表Tab.1 List of the sample and outgroup species

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

黃山粉蠅P.huangshanensisFanetChen, 1997

雄性：足黑，轉(zhuǎn)節(jié)黃，膝最末端黃。腹卵形，底色黑，覆有不規(guī)則棋盤狀可變色金色粉被。肛尾葉略短于側(cè)尾葉，側(cè)陽體細直，側(cè)突細長，呈S形彎曲，末端短于下陽體末端。下陽體末端擴大。其余該蠅種體長、頭部、胸部、翅、足、腹部特征同《中國動物志, 昆蟲綱. 第六卷, 雙翅目, 麗蠅科》中黃山粉蠅記述。

觀察標(biāo)本：♂，2018年4月，聶國嬡采自南京，北緯31°59′3″、東經(jīng)118°43′49″。

國內(nèi)分布：北京，陜西(黃龍)，安徽(黃山，模式產(chǎn)地)，浙江(莫干山、天目山)，福建(黃崗山)。

2.2 PCR擴增

所擴增的蠅類COI基因的長度大約750 bp(圖2)，與COI序列大小相似(Renaudetal., 2012)。

圖2 捕獲蠅種COI基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoregram of COI genes for the flyM：Marker 100～2.5 kb; 1：為捕獲蠅類；2：陰性對照；3：陽性對照.M：Marker 100～2.5 kb; 1：Sample captured; 2: Negative control; 3: Positive control.

圖3 基于COI基因序列構(gòu)建的NJ聚類樹Fig.3 Neighbor-joining clustering tree based on COI

2.3 序列分析

測序后拼接獲得截獲蠅種的序列長度為658 bp，(G+C)含量為33.4%，(A+T)含量為66.6%，符合昆蟲線粒體DNA中堿基(A+T)含量比堿基(G+C)含量高的相關(guān)研究結(jié)果(Riveraetal., 2009; Renaudetal., 2012)。

2.4 DNA條形碼分析

NCBI Blast結(jié)果表明，與游蕩粉蠅(登錄號為：MG116827.1、 MG120878.1、 MG120403.1)的COI序列相似度均為90.73%。將測得的序列上傳至GenBank，登記號為：MN688573。以家蠅為外群，選用Kimura 2-parameter 模型以鄰接法構(gòu)建聚類樹。如下圖3所示，捕獲蠅類與游蕩粉蠅遺傳距離較近，聚成一支。再結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定其為黃山粉蠅。

3 討論

《中國動物志 昆蟲綱 第六卷 雙翅目 麗蠅科》詳細記錄了黃山粉蠅的形態(tài)特征及其在國內(nèi)的分布，但對于其DNA分子條形碼未見相關(guān)報道。以往也沒有相關(guān)文獻報道黃山粉蠅的危害，對其生態(tài)習(xí)性的記載也不詳，作者是在綠化建設(shè)完善的辦公區(qū)域捕獲該蠅種。有記載該屬蠅類卵生，幼蟲通常寄生于蚯蚓，也有寄生于鱗翅目的記錄。3～10月份即可在戶外捕獲該屬成蟲，捕獲的最高海拔可達2 500 m(范滋德，1992；Rognes, 1992；2010)。

隨著貿(mào)易往來的頻繁、交通的便捷、旅游的發(fā)展，貨物、交通工具、人員及行李常會攜帶一些病媒生物，導(dǎo)致蠅類及其他一些病媒生物突破地理障礙，在新區(qū)域定殖并傳播的概率增大。1958年首次在北美報道游蕩粉蠅，到如今美國從東海岸到加拿大的不列顛哥倫比亞省南部都有其分布(Jewiss-Gainesetal., 2012)。本屬蠅類部分種類攜帶大量的病原體，對人類的健康及疫病流行的威脅越來越大。有相關(guān)文獻報道，本屬中的粗野粉蠅大量聚集會提高病原體傳播的潛在風(fēng)險(Fauldeetal., 2001；魏曉雅等，2016；杜鵑等，2019)。由于對于黃山粉蠅的研究甚少，不可排除其存在的潛在危害。在今后的研究中將會完善黃山粉蠅的生態(tài)習(xí)性及危害作用，該種在江蘇省首次發(fā)現(xiàn)，測序并上傳了其DNA序列，完善了粉蠅屬DNA條形碼庫。同時對蠅類的有效防治、控制疫情的擴散、防止物種入侵有著重要意義。