旋毛蟲感染對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠 腸道菌群的影響*

莊清慧 于 艷 張 楠 杜素琴 黃京京 程喻力 諸欣平

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 100069)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、全身性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為對稱性小關(guān)節(jié)的慢性炎癥、骨侵蝕和軟骨破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴(yán)重威脅患者健康。RA的發(fā)生和發(fā)展受遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素的影響。其中，腸道菌群在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用近年逐步受到關(guān)注。當(dāng)將關(guān)節(jié)炎小鼠的糞便懸液灌入無菌小鼠的胃中，無菌小鼠顯示出更高的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)率(Liuetal., 2016a)；而使用益生菌或抗生素人為調(diào)節(jié)腸道菌群使RA患者腸道微生物群正?；?，能在一定程度上抑制RA的發(fā)病及進(jìn)展，甚至改善RA的病情(Monsarratetal., 2013; Ozdemiretal., 2013; Chenetal., 2016)。

研究表明，寄生蟲能夠與宿主的腸道菌群相互作用。一方面，寄生蟲感染可以影響宿主腸道菌群組成，進(jìn)而影響宿主健康；另一方面，菌群能夠影響寄生蟲的活力和感染力。有研究發(fā)現(xiàn)，蠕蟲感染可以通過啟動宿主免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)腸道共生菌和致病菌的平衡，并由此影響免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生和發(fā)展(Ramananetal., 2016)。

旋毛形線蟲Trichinellaspiralis簡稱旋毛蟲，成蟲主要寄生于宿主小腸粘膜，幼蟲寄生在同一宿主的橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，在肌肉內(nèi)形成幼蟲囊包，感染的不同時期能引起小鼠腸道菌群不同的變化(Liuetal., 2019)。我們前期的研究證明，在小鼠關(guān)節(jié)炎造模前，預(yù)先感染旋毛蟲可有效預(yù)防小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-Ⅱ induced arthritis，CIA)的發(fā)生和發(fā)展(Chengetal., 2018)，但旋毛蟲感染對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的改善作用是否與腸道菌群調(diào)節(jié)有關(guān)尚不清楚。因此，本研究利用16S rDNA測序，探究預(yù)先感染旋毛蟲對CIA小鼠腸道菌群的影響，再進(jìn)一步分析差異菌屬與關(guān)節(jié)炎評分的相關(guān)性，為深入分析旋毛蟲感染對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的改善作用及其可能的機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與蟲株

實驗動物：DBA/1雄性小鼠，8～10周齡，SPF級，購自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

旋毛蟲蟲株：源自本實驗室ICR鼠傳代保種的黑龍江豬源旋毛蟲 (ISS 533)。

1.2 主要試劑

牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(Complete Freund′s adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund′s adjuvant, IFA)購自美國Chondrex公司，Gene JET膠回收試劑盒、Ion Plus Fragment Library Kit試劑盒購自美國Thermo公司。

1.3 實驗動物分組及造模

將15只DBA/1小鼠隨機(jī)分成3組，包括正常對照組(Control組)、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎組(CIA組)、預(yù)先感染旋毛蟲關(guān)節(jié)炎組(CIA.TS組)，每組5只。CIA.TS組在關(guān)節(jié)炎造模前14 d，預(yù)先按照400條/只旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)口感染DBA/1小鼠。造模當(dāng)天，將濃度為2 mg/mL的牛Ⅱ型膠原與等體積的完全弗氏佐劑混合，超聲乳化完全，在距小鼠尾根部1.5 cm處進(jìn)行皮內(nèi)免疫(100 μL/只)；首次免疫后第21 d，將牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑等量混合并乳化，于背部皮內(nèi)多點注射加強免疫(100 μL/只)，制備CIA模型。

1.4 小鼠關(guān)節(jié)炎的評分標(biāo)準(zhǔn)

從首次免疫后的第21 d開始，隔天記錄各組小鼠的關(guān)節(jié)炎評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0=無關(guān)節(jié)炎癥狀；1=1個足趾出現(xiàn)紅腫；2=2個足趾紅腫，但未累及足掌；3=3個以上的關(guān)節(jié)紅腫；4=紅腫累及踝關(guān)節(jié)(Cuzzocreaetal., 2005)，記小鼠4個足爪的總分為該鼠的關(guān)節(jié)炎評分。

1.5 小鼠糞便采集及DNA 提取

在關(guān)節(jié)炎造模后第50 d，在超凈臺中采集小鼠的新鮮糞便于無菌離心管中，迅速置于液氮罐中冷卻，保存于超低溫冰箱(-80 ℃)備用。使用CTAB方法提取樣本總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

對一個一直在堅持做到最好的人來說，到達(dá)一個終點的意義不過是證實他的選擇和堅持，于此，我更能理解他所說的拿到MS以后對工作和生活影響并不大，因為，很多的變化，早已經(jīng)發(fā)生在他走向侍酒師大師的這一路，潛移默化，一步一個腳印。

1.6 16S rDNA的擴(kuò)增和測序

采用16S rDNA V3-V4可變區(qū)通用引物341F (5’→3’: C C T A Y G G G R B G C A S C AG)和806R (5’→3’: G G A C T A C N N G G G T A T C T A AT) 進(jìn)行特異性擴(kuò)增(Klindworthetal., 2013)，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；然后進(jìn)行PCR 產(chǎn)物電泳，用Gene JET 膠回收試劑盒切膠回收目的片段。最后采用Ion Plus Fragment Library Kit試劑盒進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建，經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測合格后，交由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行HiSeq2500測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

為了得到可靠準(zhǔn)確的分析結(jié)果，對數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾后得到有效數(shù)據(jù)(Clean reads)，再對所有樣品的全部 Clean reads 進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列按操作分類單元(OTUs，Operational Taxonomic Units)進(jìn)行聚類，選取OTUs的代表性序列進(jìn)行物種注釋和分析。使用相應(yīng)軟件繪制稀釋曲線；計算Chao1、Simpson，ace指數(shù)進(jìn)行Alpha多樣性分析(Griceetal., 2009; Lietal., 2013)；根據(jù)weight-unifrac 距離矩陣進(jìn)行PCoA分析。最后，利用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差體現(xiàn)，三組及以上數(shù)據(jù)的組間顯著性差異采用單因素方差分析，并進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠關(guān)節(jié)炎評分

于首次膠原誘導(dǎo)后第21 d開始記錄各組小鼠關(guān)節(jié)炎評分，結(jié)果顯示， CIA.TS組小鼠的關(guān)節(jié)炎評分顯著低于CIA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明預(yù)先感染旋毛蟲緩解了膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)炎癥，即預(yù)先感染旋毛蟲對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)性作用(圖1)。

圖1 各組小鼠關(guān)節(jié)炎評分結(jié)果Fig.1 The arthritic scores of mice Control：正常對照組；CIA：膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎組；CIA.TS：預(yù)先感染旋毛蟲關(guān)節(jié)炎組。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，* P<0.05；**P<0.01；ns, 表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 Control: Control mice; CIA: CIA mice; CIA.TS: CIA mice infected with T. spiralis. The values are presented as the mean± SD. *P<0.05, **P<0.01, ns, no significance.

表1 各樣本測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析Tab.1 Statistical analysis of samples

2.2 各樣本測序結(jié)果的質(zhì)量分析

對15個樣本的16S rDNA 基因的V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出1 170 646個優(yōu)質(zhì)16S rDNA基因序列，每個樣本平均有78 043個序列(范圍70 534～80 215)，長度范圍在398～411 bp，符合16S rDNA基因的 V3-V4 區(qū)序列長度。各樣本的OTU 范圍為303～551，腸道菌群的物種覆蓋度大于0.99，表明本研究測序覆蓋率和深度可滿足樣品16S 測序分析需求(表1)。我們隨機(jī)抽取樣本中一定數(shù)量的序列，并計算統(tǒng)計所代表的物種數(shù)目及構(gòu)建稀釋曲線。觀察發(fā)現(xiàn)15個樣本稀釋曲線在35 000趨向于平坦，表明測序數(shù)據(jù)深度合理，加大測序量并不會產(chǎn)生大量的新 OTU(圖2)。

圖2 各樣本稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of each mouse C11-15：正常對照組；CIA11-CIA15：膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎組；CIA.TS11- CIA.TS15：預(yù)先感染旋毛蟲關(guān)節(jié)炎組。橫坐標(biāo)為從某個樣本中隨機(jī)抽取的測序條數(shù)，縱坐標(biāo)為基于該測序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量。 C11-15: Control mice; CIA11-CIA15: CIA mice; CIA.TS11-CIA.TS15: CIA.TS mice. The abscissa is the sequences number randomly selected from each mouse, and the ordinate is the observed species number that can be constructed based on the sequences number.

2.3 各組小鼠腸道菌群的Alpha多樣性分析

為了解析群落內(nèi)部的物種組成情況，采用Alpha多樣性分析的方法對每個樣品進(jìn)行分析。由圖3可知，與Control組相比，CIA組的Chao1、Ace和Simpson指數(shù)有上升趨勢，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而與CIA組相比，CIA.TS組的Chao1、Ace和Simpson指數(shù)有下降趨勢，更接近Control組。該結(jié)果提示，CIA小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性有增加趨勢，而預(yù)先感染旋毛蟲可以在一定程度上降低關(guān)節(jié)炎小鼠腸道菌群豐富度和多樣性。

圖3 各組小鼠Alpha多樣性分析Fig.3 Alpha diversity of each group A：chao 1指數(shù)；B：ace 指數(shù)；C：Simpson 指數(shù). A: chao 1 index; B: ace index; C: Simpson index.

2.4 各組小鼠腸道菌群的PCoA分析

為了對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析，我們采用主坐標(biāo)分析法(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，每個樣本以點的形式反映在圖上，再通過點與點間的距離反映樣本的組間差異。其中橫坐標(biāo)為第1主成分，其對樣本差異的貢獻(xiàn)率為54.89%；縱坐標(biāo)為第2主成分，其對樣本差異的貢獻(xiàn)率為21.6%。由圖4可知，CIA組與Control組小鼠腸道菌群群落之間相距較遠(yuǎn)；而CIA.TS 組小鼠的腸道群落與Control組相距較近。該結(jié)果提示，CIA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而預(yù)先感染旋毛蟲改善了CIA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變。

圖4 各組主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal Co-ordinates Analysis of each group

2.5 各組小鼠腸道菌群在門分類水平的差異

根據(jù)測序結(jié)果中各物種在門水平 OTUs 的相對豐度數(shù)值，對各組小鼠腸道菌群中門水平排名前十的菌門進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。由圖5可知，與Control組相比，CIA組小鼠腸道菌群中的脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)的豐度顯著增加(P<0.05)；而預(yù)先感染旋毛蟲的CIA.TS組與CIA組對比，小鼠腸道菌群中的脫鐵桿菌門和變形菌門的豐度顯著減少(P<0.05)，梭桿菌門的豐度也有減少趨勢(雖無統(tǒng)計學(xué)差異P>0.05，但接近Control組水平)。該結(jié)果提示，CIA組小鼠腸道菌群在門水平上3種差異菌豐度顯著上升，而預(yù)先感染旋毛蟲部分恢復(fù)了3種菌的豐度，接近對照組水平。

圖5 各組小鼠腸道菌群在門分類水平的差異Fig.5 Differences in microbial relative abundance of each group at phylum level A：各組小鼠腸道菌群在門水平上的分布；B：各組小鼠腸道菌群在門水平上的差異分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05；**P<0.01；ns, 表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 A: Distribution of the microbial communities of each group at phylum level; B: Differences in microbial relative abundance of each group at phylum level. The values are presented as the mean± SD. *P<0.05, **P<0.01, ns, no significance.

2.6 各組小鼠腸道菌群在屬分類水平的差異

進(jìn)一步對各組小鼠腸道菌群中物種相對豐富度排名靠前的30名菌屬進(jìn)行比較分析。從圖6可知，與Control組相比，CIA組小鼠腸道菌群中厚壁菌門的未分類毛螺菌科(unidentified_Lachnospiraceae)、脫鐵桿菌門的Mucispirillum屬和變形菌門中脫硫弧菌屬Desulfovibrio的豐度明顯增加(P<0.05)，擬桿菌門中Alistipes屬和理研菌屬Rikenella的豐度明顯減少(P<0.05)；而與CIA組相比，CIA.TS組小鼠腸道菌群中Mucispirillum屬和脫硫弧菌屬的豐度(P<0.05)明顯減少，未分類毛螺菌科的豐度有減少趨勢，理研菌屬的豐度明顯增加(P<0.05)，Alistipes屬的豐度有增加趨勢。該結(jié)果提示，CIA小鼠腸道菌群在屬水平上菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而預(yù)先感染旋毛蟲對CIA小鼠腸道菌群失調(diào)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

2.7 差異菌屬的相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與關(guān)節(jié)炎疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，我們將CIA組和Control組之間的差異菌屬與關(guān)節(jié)炎評分進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。由圖7可知，CIA小鼠中豐度顯著升高的未分類毛螺菌科、Mucispirillum屬和脫硫弧菌屬，其相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分都呈顯著正相關(guān)；而豐度顯著降低的Alistipes屬的相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分呈顯著負(fù)相關(guān)，理研菌屬的相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分也呈負(fù)相關(guān)(雖無統(tǒng)計學(xué)意義)。該結(jié)果提示，CIA小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變與關(guān)節(jié)炎疾病嚴(yán)重程度具有顯著相關(guān)性。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬分類水平的差異Fig.6 Differences in microbial relative abundance of each group at genus level A：各組小鼠腸道菌群在屬水平上的分布；B：各組小鼠腸道菌群在屬水平上的差異分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，* P<0.05；**P<0.01；ns, 表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 A: Distribution of the microbial communities of each group at genus level; B: Differences in microbial relative abundance of each group at genus level. The values are presented as the mean± SD. *P<0.05, **P<0.01, ns, no significance.

圖7 屬水平的差異菌相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分相關(guān)性分析Fig.7 Spearman correlations between microbial relative abundance and arthritic scores A：未分類毛螺菌科；B：Mucispirillum屬；C：脫硫弧菌屬；D：Alistipes屬；E；理研菌屬. A: unidentified_Lachnospiraceae; B: Mucispirillum; C: Desulfovibrio; D: Alistipes; E: Rikenella.

3 討論

近年來，大量研究報道蠕蟲感染或其蟲源性分子對炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展具有一定抑制作用。越來越多的動物模型研究表明，某些寄生蟲感染對炎癥性疾病的保護(hù)作用與其對宿主腸道菌群的調(diào)節(jié)作用有關(guān)(Blanderetal., 2017)。腸道菌群是一個極其復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，在維持機(jī)體健康方面起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是攜帶著機(jī)體“第二基因組”的另一個“隱藏器官”(Congetal., 2015)。腸道微生物可能作為一種調(diào)節(jié)介質(zhì)，通過影響?zhàn)つぜ叭砻庖吖δ芏绊懨庖呦到y(tǒng)疾病。本實驗采用16S rDNA 測序技術(shù)對各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，以從腸道菌群調(diào)節(jié)的角度探究預(yù)先感染旋毛蟲對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的改善作用。

對于關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群多樣性的改變目前尚有爭論，有研究表明其菌群多樣性的改變與疾病進(jìn)程的不同時期相關(guān)(Liuetal., 2016b; Xiaoetal., 2018)。本研究在關(guān)節(jié)炎造模后第50 d收集小鼠的糞便，通過對16S rDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，CIA組小鼠菌群的多樣性較Control組小鼠有所升高。

本研究在門水平上對各菌門相對豐度統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，CIA組小鼠脫鐵桿菌門、變形菌門和梭桿菌門的相對豐度顯著增加，在屬水平上未分類毛螺菌科、Mucispirillum屬和脫硫弧菌屬的相對豐度顯著增加，Alistipes屬和理研菌屬的相對豐度顯著減少。有研究表明，毛螺科菌與腸道炎癥程度呈正相關(guān)(Liuetal., 2016b)，還能夠參與代謝紊亂、糖尿病和結(jié)腸癌的發(fā)生(Xieetal., 2016)。在RA患者腸道菌群的研究中也發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎發(fā)作之后，毛螺菌科的豐度明顯升高(Liuetal., 2016b)。Mucispirillum屬主要寄居于腸粘液層，其主要功能為降解粘蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，Mucispirillum屬與腸道炎癥和自身免疫性疾病相關(guān)。例如，在感染性結(jié)腸炎的小鼠模型中，結(jié)腸表面黏液層的早期破壞與Mucispirillum豐度增加有關(guān)(Berryetal., 2015; Loyetal., 2017)。Dzierzewicz等(2006)的研究發(fā)現(xiàn)，脫硫弧菌是一種革蘭陰性厭氧硫酸鹽還原菌，能夠刺激上皮免疫應(yīng)答，促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致人類腸道中產(chǎn)生有毒的硫化氫。本研究中CIA組小鼠脫硫弧菌屬的相對豐度顯著增加，與Dzierzewicz的研究結(jié)果相一致。另外，本研究中一個重要的發(fā)現(xiàn)是，關(guān)節(jié)炎小鼠中豐度顯著性升高的未分類毛螺菌科、Mucispirillum屬和脫硫弧菌屬的相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分呈正相關(guān)，而豐度顯著性降低的Alistipes屬和理研菌屬的相對豐度與關(guān)節(jié)炎評分呈負(fù)相關(guān)，而預(yù)先感染旋毛蟲可使CIA小鼠腸道菌群中未分類毛螺菌科、Mucispirillum屬和脫硫弧菌屬的相對豐度降低，Alistipes屬和理研菌屬的相對豐度升高，提示旋毛蟲感染對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥的抑制作用與其對CIA小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

綜上所述，CIA可導(dǎo)致小鼠腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，從穩(wěn)態(tài)變?yōu)椤把仔浴睜顟B(tài)，菌群多樣性上升，尤其是一些促炎菌的豐度明顯升高；而預(yù)先感染旋毛蟲后，CIA小鼠的菌群豐富度有所降低，更接近正常小鼠的水平，且能有效恢復(fù)關(guān)節(jié)炎小鼠在門和屬水平上腸道菌群構(gòu)成和豐度的改變。因此，我們推測預(yù)先感染旋毛蟲對關(guān)節(jié)炎的緩解作用與菌群調(diào)節(jié)有關(guān)，而旋毛蟲感染經(jīng)調(diào)節(jié)腸道菌群抑制CIA發(fā)生的可能機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。