改良法制備冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用〔1〕

張秀華，邱新璐，賴(lài)建秀，康美艷，何燕琴

(贛州市中心血站，江西 贛州 341000)

RH(-)血型屬稀有血型，約占3%，目前普通懸浮紅細(xì)胞在2～6 ℃保存時(shí)間最長(zhǎng)為35 d[1]。冰凍紅細(xì)胞保存技術(shù)主要用于RH(-)血液，以節(jié)約血液資源，同時(shí)確保臨床RH(-)患者應(yīng)急輸用[2]。冰凍紅細(xì)胞保存技術(shù)主要使用復(fù)方甘油保護(hù)劑，而如何快速解凍并最大程度去除冰凍紅細(xì)胞中甘油、上清血紅蛋白含量成分，減少解凍去甘油過(guò)程對(duì)紅細(xì)胞的損耗，有效提高紅細(xì)胞的回收率或血紅蛋白含量，保障產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，對(duì)臨床RH(-)血型急救患者及時(shí)有效的血液輸注、成功搶救患者生命具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

起始血液：保存6 d內(nèi)的去白懸浮紅細(xì)胞；選用設(shè)備：BBS926全自動(dòng)醫(yī)用低速離心機(jī)、搖擺機(jī)。

1.2 改進(jìn)前存在的缺點(diǎn)

用南格爾BBS926全自動(dòng)醫(yī)用低速離心機(jī)制備冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞所需時(shí)間長(zhǎng)，紅細(xì)胞回收率低，甘油殘留率和上清血紅蛋白殘留量高。

1.3 方法

2014年7月—2016年6月我站進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于技術(shù)改良前、技術(shù)改良后分兩組制備共30袋，原始血液為6 d內(nèi)的去白懸浮紅細(xì)胞的冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞產(chǎn)品，將其分為改良組和原始組，每組15 袋。通過(guò)檢測(cè)解凍紅細(xì)胞壓積，用于機(jī)器自動(dòng)洗滌去甘油時(shí)依次用9%NaCl，9%NaCl加0.9%NaCl，0.9%NaCl進(jìn)行遞度稀釋細(xì)胞內(nèi)外甘油濃度。改良組制備技術(shù)：對(duì)南格爾型號(hào)為BBS926自動(dòng)醫(yī)用低速離心機(jī)進(jìn)行程序改進(jìn)，將加甘油后保留所有甘油成分進(jìn)行冰凍的程序改良為離心去除己甘油化紅細(xì)胞中上清成分的100 mL。原始組則在改進(jìn)前制備，制備方法按照設(shè)備廠家最初設(shè)定的程序進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)

按照《全血及成分血質(zhì)量要求》(GB18469-2012)中的檢測(cè)方法[3]，對(duì)兩組終產(chǎn)品的游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細(xì)胞殘留量進(jìn)行檢測(cè)，并記錄兩組制備時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組終產(chǎn)品各指標(biāo)的比較

兩組終產(chǎn)品各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示：原始組各項(xiàng)指標(biāo)均滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍，證明原始方法所制備的終產(chǎn)品合格。技術(shù)改良后，改良組終產(chǎn)品紅細(xì)胞回收率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，終產(chǎn)品上清游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細(xì)胞殘留量四項(xiàng)指標(biāo)比原始組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上指標(biāo)在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提升了血液輸注的安全性(見(jiàn)表1)。

2.2 兩組制備1 U時(shí)冰凍及溶解時(shí)間比較

制備1 U時(shí)，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需時(shí)間及溶解時(shí)間均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表1 兩組終產(chǎn)品各指標(biāo)的比較

表2 兩組制備1 U時(shí)的冰凍時(shí)間及溶解時(shí)間比較

2.3 兩組制備2 U時(shí)冰凍及溶解時(shí)間比較

制備2 U時(shí)，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需要時(shí)間以及溶解時(shí)間均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 兩組制備2 U時(shí)冰凍及溶解時(shí)間比較

3 討 論

RH(-)血液稀少，為滿(mǎn)足臨床RH(-)患者輸血的需要，血站常需要庫(kù)存一定量的RH(-)血液[4]。但是臨床需要RH(-)血型的人員不定或偶有突發(fā)事件時(shí)需要量超出庫(kù)存數(shù)量，如果臨時(shí)去采集RH(-)血型的血液，招募、采血、檢測(cè)等過(guò)程會(huì)花費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)于臨床上需要等血救命的患者來(lái)說(shuō)很不利[5]。近年來(lái)，我國(guó)臨床上對(duì)治療用血液的需求量逐年增加，國(guó)內(nèi)研究指出[6]，血液的使用量在許多三甲醫(yī)院中逐年增多，具有RH(-)陰性血型的人群在我國(guó)占比較少，以人數(shù)最多的漢族為例，其中RH(-)血型比例也僅僅只占0.3%～0.5%。因此，為滿(mǎn)足上述需求，提高臨床治療效率以及需求量，利用技術(shù)將RH(-)血液進(jìn)行長(zhǎng)期保存，對(duì)于目前醫(yī)療水平而言是最理想的方法。

為了能給臨床RH(-)患者在最短的時(shí)間內(nèi)輸注安全的血液，我站一直采用南格爾BBS926全自動(dòng)醫(yī)用低速離心機(jī)制備冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞技術(shù)，但遇到應(yīng)急、突發(fā)狀況時(shí)仍存在問(wèn)題。基于此，我站在手工制備冰凍解凍去甘油的基礎(chǔ)上，引進(jìn)全自動(dòng)低速離心機(jī)，并進(jìn)行程序改良：將加甘油后保留所有甘油成分進(jìn)行冰凍的程序改良為離心去除己甘油化紅細(xì)胞中上清成分100 mL，提高冰凍紅細(xì)胞保存時(shí)的冷凍速率，減少解凍時(shí)的融化時(shí)間，從而減少紅細(xì)胞冰凍解凍過(guò)程的損耗。兩組終產(chǎn)品各指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示：原始組各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，證明原始方法所制備的終產(chǎn)品合格。技術(shù)改良后，改良組終產(chǎn)品紅細(xì)胞回收率比原始組明顯升高(P<0.05)，上清游離血紅蛋白含量、甘油殘留量、血小板殘留量以及白細(xì)胞殘留量四項(xiàng)指標(biāo)比原始組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以上指標(biāo)在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提升了血液輸注安全性。甘油在冰凍保存紅細(xì)胞時(shí)，是一種天然的細(xì)胞內(nèi)低溫保護(hù)劑，對(duì)于紅細(xì)胞冰凍、解凍時(shí)起保護(hù)作用[7]。人體紅細(xì)胞在低溫下會(huì)產(chǎn)生大量冰晶，對(duì)紅細(xì)胞的細(xì)胞膜可能產(chǎn)生機(jī)械性損傷，且低溫引起的滲透壓變化也可能使紅細(xì)胞內(nèi)受到化學(xué)損傷[8]，甘油對(duì)以上兩種損傷都存在保護(hù)作用，且劉曉洋等[9]研究指出，甘油同時(shí)還可提高紅細(xì)胞回收率，應(yīng)用極為廣泛。但這些紅細(xì)胞在投入臨床應(yīng)用時(shí)，甘油必須經(jīng)過(guò)洗滌處理[10]，達(dá)到國(guó)標(biāo)所規(guī)定的殘留量(<10 g/L)。我站在實(shí)際使用中發(fā)現(xiàn)，機(jī)器洗滌有時(shí)也會(huì)存在接近于10 g/L的殘留量，因此提出了改進(jìn)方法。而對(duì)于游離血紅蛋白、血小板以及白細(xì)胞而言，這三項(xiàng)指標(biāo)是在紅細(xì)胞投入臨床輸血應(yīng)用時(shí)引起患者機(jī)體不良或過(guò)敏反應(yīng)的主要因素，需嚴(yán)格控制其在終產(chǎn)品中的含量，原始的機(jī)器法可達(dá)到較為理想的殘留量水平，但我站經(jīng)過(guò)改良后，以上三種物質(zhì)含量均進(jìn)一步下降。此外，本次研究結(jié)果還顯示：制備1 U和制備2 U時(shí)，改良組下降至0 ℃和-50 ℃所需時(shí)間及溶解時(shí)間均低于原始組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。機(jī)器制備法雖相對(duì)于傳統(tǒng)的手工制備法在效率、質(zhì)量上存在一定優(yōu)勢(shì)，但其在材料資源消耗、制備成本方面存在一定劣勢(shì)[11]，這使得提高機(jī)器制備法的效率顯得尤為重要。本次改良后的制備程序可有效提高冰凍紅細(xì)胞保存時(shí)的冷凍速率，減少解凍時(shí)融化時(shí)間，從而在減少紅細(xì)胞冰凍解凍過(guò)程損耗的同時(shí)，縮短了制備時(shí)間，提高了效率。

綜上所述，通過(guò)開(kāi)展冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞改良制備方法，縮短了冰凍解凍去甘油紅細(xì)胞的制備時(shí)間，提高了產(chǎn)品紅細(xì)胞回收率，進(jìn)一步降低了甘油殘留率及上清血紅蛋白殘留量，使產(chǎn)品質(zhì)量保持持續(xù)穩(wěn)定。