海珠益肝加味方對刀豆蛋白A誘導免疫性肝損傷小鼠的保護作用

張云城 盛國光 胡世平

摘要 目的：探討海珠益肝加味方對刀豆蛋白A（Concanavalin A）誘導免疫性肝損傷小鼠的保護作用。方法：健康昆明雄性小鼠100只，隨機分為10組，包括正常組、模型組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組，每組10只，造模兩周前，正常組及模型組給予溫開水灌胃，其余組分別給予海珠益肝全方，海珠益肝方加太子參、枸杞子，海珠益肝方加太子參、淫羊藿，海珠益肝方加枸杞子、淫羊藿、葉下珠、白花蛇舌草、海藻、茯苓、白芥子、莪術及潑的松灌胃，靜待60 min后，正常組給予尾靜脈注射8 mL/kg生理鹽水，其他組給予尾靜脈注射16 mg/kg Concanavalin A建模，期間暫停飲水并靜待12 h后摘眼球取血、頸椎脫臼處死動物取肝臟脾臟，計算肝脾指數(shù)。并檢測ALT、AST、SOD及MDA指標。結果：正常組、A組、B組、C組、D組、G組、H組的小鼠肝脾指數(shù)明顯低于模型組，其他組無明顯作用，正常組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組的ALT、AST、SOD明顯高于模型組（P<0.05），正常組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組的MDA明顯低于模型組（P<0.05）。結論：海珠益肝方加味方能有效降低免疫性肝損傷轉氨酶水平，減輕肝細胞膜脂質過氧化反應，從而達到保護肝臟的目的。

關鍵詞 海珠益肝加味方;刀豆蛋白A;免疫性肝損傷;肝脾指數(shù);丙氨酸氨基轉移酶;天門冬氨酸氨基轉移酶;超氧化物歧化酶;丙二醛

Abstract Objective：To investigate the protective effects of Modified Haizhu Yigan Formula on mice with Concanavalin A（Concanavalin A）-induced immune liver injury.Methods：A total of 100 Kunming mice were randomly divided into normal group，model group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，group G and group H，with 10 cases in each group.2 weeks before modeling，the normal group and model group were given warm boiled water by gastric lavage.The other groups were given Haizhu Yigan Formula，Haizhu Yigan Formula plus Radix Pseudostellariae and Fructus Lyci，Haizhu Yigan Formula plus Radix Pseudostellariae Xianlingpi，Haizhu Yigan Formula plus Fructus Lycii Xianlingpi，YexiaZhu Baihua Sheshecao，Haizao Poria，Bai Jiezi，Rhizoma Curcumae and Podisong for gastric perfusion.After 60 minutes，the normal group was injected with 8 mL/kg normal saline by caudal vein，the other groups were injected with 16 mg/kg Concanavalin A by caudal vein.During this period water was suspended.After waiting for 12 h，remove eyeballs and take blood.The animals were sacrificed by cervical dislocation and the liver and spleen were taken to calculate the liver-spleen index.The indexes of ALT，AST，SOD and MDA were detected.Results：The liver and spleen indexes of normal group，group A，group B，group C，group D，group G and group H were significantly lower than those of model group，but the other groups had no obvious effects.ALT，AST and SOD in normal group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，group G and group H were significantly higher than those in model group.The MDA levels in normal group，group A，group B，group C，group D，group E，group F，G group G and group H were significantly lower than those in model group（P<0.05）.Conclusion：Modified Haizhu Yigan formula can effectively reduce the level of ammonia transfusion in immunological liver injury，reduce the lipid peroxidation of liver cell membrane，so as to achieve the purpose of protecting liver.

Keywords Modified Haizhu Yigan Jiawei Formula; Concanavalin A; Immunological liver injury; Liver and spleen index;ALT; AST;SOD;MDA

海珠益肝加味方是湖北省中醫(yī)院肝病科盛國光教授根據(jù)中醫(yī)理論，創(chuàng)造臨床上治療慢性乙型肝炎的協(xié)定方，主要組成有葉下珠、海藻、白花蛇舌草、白芥子、茯苓、莪術等，有清熱解毒、健脾化痰、活血祛瘀之功效。其降轉氨酶的作用最為顯著，但該藥物的應用機制還需進一步研究[1-2]。我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，其中慢性乙型病毒性肝炎（CHB）占大多數(shù)，臨床上用海珠益肝加味方治療CHB十分有效[3]。用刀豆蛋白A（Concanavalin A）誘導的小鼠急性肝損傷模型具有操作簡單、肝臟特異性等特點廣泛應用于各種肝病的研究中[4-5]。對此，本研究為確保海珠益肝加味方治療慢乙肝有效的機制，我們通過建立建模實驗探討海珠益肝加味方對Concanavalin A誘導免疫性肝損傷小鼠的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

昆明小鼠，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008-0008，共100只，5周齡，雄性，體質量18～22 g。小鼠由提供方喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物

海珠益肝全方，海珠益肝方加太子參、枸杞子，海珠益肝方加太子參、淫羊藿，海珠益肝方加枸杞子、淫羊藿、葉下珠、白花蛇舌草、海藻、茯苓、白芥子、莪術均由湖北省中醫(yī)院制劑室提供，潑尼松片（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020771），所有藥物劑量依據(jù)說明應用。

1.1.3 試劑與儀器

Concanavalin A（C2010，批號：80M7680V）購自Sigma公司。丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考馬斯亮蘭試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號依次為20120410、20120407、20120412、20120413、20120406）。美譜達UV6100S可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

所有小鼠均給予正常飼養(yǎng)1周后，將100只小鼠隨機分為正常組、模型組、A—H組，每組10只，即A組（潑尼松）、B組（海珠益肝方全方）、C組（海珠益肝方加太子參、枸杞子）、D組（海珠益肝方加太子參、淫羊藿）、E組（海珠益肝方加淫羊藿、枸杞子）、F組（葉下珠、白花蛇舌草）、G組（海藻、茯苓、白芥子）、H組（莪術）。根據(jù)文獻[6]，在療程結束后60 min，給予正常組所有小鼠尾靜脈靜注氯化鈉溶液10 mL/kg，其他各組給予小鼠尾靜脈靜注20 mg/kg Concanavalin A+0.9%的氯化鈉溶液稀釋，濃度為2 mg/mL。

1.2.2 給藥方法

正常組和模型組給予溫開水干預，其余組給予藥物干預，即A組（7.8 mg/kg潑尼松）、B組（9.5 mL/kg海珠益肝方全方）、C組（13.4 mL/kg海珠益肝方加太子參、枸杞子）、D組（13.4 mL/kg海珠益肝方加太子參、淫羊藿）、E組（13.4 mL/kg海珠益肝方加淫羊藿、枸杞子）、F組（3.9 mL/kg葉下珠、白花蛇舌草）、G組（4.8 mL/kg海藻、茯苓、白芥子）、H組（0.78 mL/kg莪術），1 d/次，療程為2周。

1.2.3 檢測指標與方法

肝組織指標檢測，取10組小鼠的肝組織在4 ℃氯化鈉溶液中漂洗，除去相關雜質后風干，稱取肝組織0.20 g，制成10%勻漿與無菌試管中，分離勻漿（3 000 r/min，10 min）后，通過考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒檢測總蛋白濃度。酶聯(lián)免疫吸附法檢測SOD水平，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定MDA含量[7-9]。肝酶檢測是取小鼠血清0.2 mL，采用賴氏法測定ALT和AST水平。肝組織病理檢查是再稱取肝組織0.20 g，經(jīng)10%甲醛固定和石蠟包埋后、連續(xù)切片進行脫蠟，切片厚度均為4 μm，根據(jù)SP法染色后于400倍視野下觀察其組織結構。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料以（%）表示采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

所有小鼠干預前后生命體征均良好，且干預后無小鼠死亡。

2.1 各組小鼠肝脾指數(shù)變化 正常組、A組、B組、C組、D組、G組、H組的小鼠肝脾指明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。E組、F組對肝脾指數(shù)影響比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠肝組織中ALT、AST的變化 正常組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組的ALT、AST明顯高于模型組，其中C組降ALT、AST水平效果更優(yōu)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。

2.3 各組小鼠肝組織MDA、SOD變化 正常組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組的SOD明顯高于模型組，正常組、A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組、H組的MDA明顯低于模型組（P<0.01或P<0.05）。見表3。

2.4 各組肝組織HE染色變化 光鏡檢查：正常組：小鼠肝臟無異常，在HE染色中肝細胞大小正常，排列整齊。模型組：HE染色的肝細胞漿顏色變淺，細胞分散，肝竇不清晰，且不見肝索，甚至有可見點狀壞死、炎細胞浸潤等表現(xiàn)。其他各組均能降低肝臟炎癥壞死，尤其是D組最為明顯，如圖1～10。

3 討論

肝臟的生理功能最為復雜，肝臟損傷的疾病發(fā)病機制相應地也變得十分復雜。Concanavalin A是一種糖類結合蛋白質，具有促有絲分裂作用，能夠促淋巴細胞轉化反應的作用[10-11]，武建毅[12]等報道靜脈注射BALB/c小鼠8～12 h內(nèi)可引起明顯的肝損害，且提示其機制可能是T細胞亞群介導，此與機體的急性肝炎發(fā)病機制相似，故Concanavalin A誘導的肝損傷老鼠模型可作為模擬人體肝損傷模型。而本研究結果顯示，給予模型老鼠藥物干預可降低Concanavalin A誘導的小鼠升高的血清轉氨酶活力，且能降低ConA誘導的急性免疫性肝損傷炎性反應遞質TNF-α水平，從而使肝細胞逐漸恢復正常形態(tài)，進一步提示在海珠益肝加味方的干預可有效預防肝損傷。由此可見，改善患者的免疫系統(tǒng)及降低炎性物質的分泌可提高肝臟功能的運行[13-15]。免疫性肝損傷的主要病機為濕毒、痰滯、血瘀，繼而痰凝，久而入血致瘀。因此，解毒化痰活血祛瘀亦為慢性肝炎治本之法。海珠益肝加味方是治療慢性肝炎的經(jīng)驗方，由葉下珠、海藻、白花蛇舌草、白芥子、茯苓、莪術組成，全方具有清熱解毒、健脾化痰、活血祛瘀之功，可有效去濕毒、痰滯、血瘀，繼而改善急性肝炎[16-17]。

臨床上我們觀察到較多慢乙肝患者病情纏綿，最后有一個急性加重發(fā)作的過程。對此，本研究通過給予小鼠海珠益肝擴方及拆方藥物干預，結果發(fā)現(xiàn)加用扶正中藥后降酶效果更佳，能夠有效提高機體免疫和降低炎性反應。另外我們還發(fā)現(xiàn)活血化瘀組單用就可以降低肝脾指數(shù)，且海珠益肝加味方能夠提高SOD水平同時降低MDA水平，繼而加強患者的抗氧化能力，提高機體的自由基清除，從而起到保護肝臟的作用[8]。

綜上所述，海珠益肝方加味能有效降低免疫性肝損傷轉氨水平，減輕肝細胞膜脂質過氧化反應，達到保護肝臟的目的。但海珠益肝加味方抗肝損傷的作用多方面的，其機制尚不清楚，故其對肝臟的免疫功能和炎性反應的干預機制有待進一步研究。

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（2018-05-08收稿 責任編輯：蒼寧）