EGCG及其絡(luò)合物EGCG-Cu的消毒效果研究

慶杉，趙巖，馮萃敏，段鵬鑫，王婷，張欣蕊，丁梓沁

(1.北京建筑大學(xué) 北京未來城市設(shè)計高精尖創(chuàng)新中心，北京 100044；2.北京建筑大學(xué) 水環(huán)境國家級實驗教學(xué)示范中心，北京 100044；3.北京外交人員服務(wù)局，北京 100010；4.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050061；5.北京市市政工程設(shè)計研究總院有限公司，北京 100082)

為解決飲用水消毒過程中產(chǎn)生的多種對人體有毒有害的消毒副產(chǎn)物問題[1-3]，采用表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate，EGCG，茶多酚中起抑菌作用的主要成分[4-12])替代傳統(tǒng)消毒劑，但其穩(wěn)定性較差。在初始濃度大、pH高、光照條件下易發(fā)生氧化聚合反應(yīng)[13]，降低抑菌能力[14]。

為增強(qiáng)EGCG的化學(xué)穩(wěn)定性及殺菌能力，選用Cu2+為中心離子[15]，EGCG為配體，采用水熱法進(jìn)行絡(luò)合[16]。選用飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)微生物指標(biāo)中最具有代表性的細(xì)菌——大腸桿菌，探索絡(luò)合物EGCG-Cu的抑菌性，以及初始投加量和反應(yīng)時間對消毒效果的影響，為茶多酚及EGCG在飲用水消毒領(lǐng)域的應(yīng)用拓展出一條新的道路。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(編號10004)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG為南京廣潤生物制品有限公司產(chǎn)品(編號GR0799)；氯化鈉、硫酸銅、碳酸氫鈉、乙醇均為分析純；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均為人工配制。

BCN-1360型生物操作臺；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱；滅菌鍋(日本，三洋，75 L)；78HW-1恒溫磁力攪拌器；臺式恒溫?fù)u床(杭州得聚儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(ThermoFisher，Multiskan FC)。

1.2 溶液配制

1.2.1 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3.6 g肉湯培養(yǎng)基(試劑)溶于200 mL蒸餾水，用電爐加熱至沸騰，再入高壓滅菌鍋滅菌備用。

1.2.2 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 6.6 g營養(yǎng)瓊脂，200 mL蒸餾水，步驟同營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2.3 無菌生理鹽水 1.7 g氯化鈉，用去離子水定容于200 mL，121 ℃滅菌30 min。選用蒸餾水作為配制菌液、溶解藥劑等實驗用水。

1.3 實驗方法

1.3.1 EGCG-Cu絡(luò)合物的制備 采用水熱法合成所需絡(luò)合物。稱取EGCG 0.5 mmol，用30 mL的蒸餾水溶解，并將1 mmol的硫酸銅配制成溶液后逐滴加入，待混勻后用1 mol/L的碳酸氫鈉將pH調(diào)節(jié)至7，在40 ℃溫度下用恒溫磁力攪拌器攪拌1 h使其充分絡(luò)合，后用1∶1的乙醇-水溶液多次洗滌沉淀，真空冷凍干燥后得EGCG-Cu。絡(luò)合反應(yīng)見圖1。

圖1 EGCG與Cu2+的絡(luò)合反應(yīng)Fig.1 Complexation reaction between EGCG and Cu2+

1.3.2 菌懸液的制備 用接種環(huán)從含有大腸桿菌的瓊脂斜面刮取一環(huán)，溶于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：溫度(37±2) ℃，220 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，時間為(8±1) h。此時的菌數(shù)約為103～109 CFU/mL。若需稀釋，用滅菌的移液槍吸取1 mL原始菌液加入到無菌生理鹽水中作梯度稀釋，并用平板計數(shù)法記錄細(xì)菌數(shù)，直至實驗所需細(xì)菌濃度。

1.3.3 最小抑菌濃度(MIC)測定 采用平皿計數(shù)法，通過對比EGCG的菌落的生長狀況來判斷EGCG-Cu是否具有抑菌效果。用生理鹽水將大腸桿菌菌懸液稀釋至104數(shù)量級，取EGCG-Cu絡(luò)合物溶液的濃度為0,12.5,25,50,100,200,400 mg/L，EGCG溶液的濃度為0,125,250,500,1 000,2 000,4 000 mg/L，對大腸桿菌進(jìn)行接觸時間為24 h，培養(yǎng)溫度為37 ℃的抑菌實驗，觀察菌落的生長情況。

1.3.4 抑菌性能影響因素分析 探究EGCG-Cu投加量和反應(yīng)時間對其抑菌效果的影響。設(shè)置EGCG-Cu的投加量為0,25,50,75,100,150,200,250,400,600,800,1 000 mg/L，將大腸桿菌菌懸液稀釋至103數(shù)量級，加入EGCG-Cu絡(luò)合物的溶液，反應(yīng)時間2 h，溫度為37 ℃。選取EGCG-Cu的投加量為25,50,75,100 mg/L，觀察其在反應(yīng)時間為15,30 min,1,6,12,24 h時的抑菌效果。為得到比較直觀的實驗結(jié)果，選用EGCG做對比實驗，EGCG的投加量選為200,400,600,800 mg/L。

1.3.5 EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇(ROS) 采用活性氧酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行檢測，將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，按說明書用緩沖液稀釋后，取0.1 mL加入反應(yīng)孔中，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液清洗3次。將稀釋過的待檢樣品0.05 mL加入已包被單抗微孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌(同時做空白對照孔)。在各孔中加入現(xiàn)配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃孵育20 min后，加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm波長下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測試樣品中的活性氧簇含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 EGCG-Cu和EGCG 的最小抑菌濃度(MIC)

最小抑菌濃度MIC是將制備的一系列藥劑稀釋液加入到有試驗菌的固體或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在一段時間的培養(yǎng)后，觀察實驗菌是否有生長，可完全抑制實驗菌生長的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度，用于定量測定藥劑的抗菌活性[17]。按上述實驗方法配制一系列濃度的EGCG和EGCG-Cu溶液進(jìn)行MIC實驗。

實驗表明，EGCG-Cu在濃度為200 mg/L時無菌落長出，EGCG在濃度為1 000 mg/L時無菌落長出，EGCG-Cu的最小抑菌濃度遠(yuǎn)小于EGCG。由此可知，EGCG-Cu絡(luò)合物不僅具有抑菌能力，而且明顯優(yōu)于EGCG。EGCG-Cu優(yōu)異的抑菌能力可能是因為革蘭氏陰性菌大腸桿菌的細(xì)胞表面有帶負(fù)電的脂多糖，而在生理pH下，EGCG不帶電，EGCG-Cu絡(luò)合物卻帶正電荷。大腸桿菌表面的負(fù)電荷可能會吸引EGCG-Cu，導(dǎo)致EGCG更易于破壞大腸桿菌的生物膜[18]，從而提高了抑菌效率。這與Sun等的研究一致[16]。也可能由于EGCG-Cu絡(luò)合物游離出的Cu2+氧化成Cu+，促進(jìn)了氧化聚合反應(yīng)的鏈引發(fā)階段的發(fā)生，從而使殺菌效果有所提升。這與馮萃敏等學(xué)者建立的EGCG氧化聚合反應(yīng)衰減模型相吻合[14]。

2.2 EGCG-Cu和EGCG 投加量對其抑菌性能的影響

EGCG-Cu和EGCG對大腸桿菌均有明顯抑菌作用，并且EGCG-Cu的抑菌效果較EGCG更優(yōu)。由圖2可進(jìn)一步得知，當(dāng)EGCG-Cu初始濃度達(dá)到150 mg/L時，細(xì)菌完全殺滅，抑菌率達(dá)到100%。初始濃度在100 mg/L時，抑菌率為95%。即使初始濃度在50 mg/L時，其對大腸桿菌的殺滅效果也很明顯，抑菌率也達(dá)到60%。對比EGCG不同濃度下的抑菌率可以看出，EGCG-Cu在較低的濃度下就可有效殺滅大腸桿菌，達(dá)到較好的抑菌效果。

圖2 EGCG-Cu絡(luò)合物和EGCG的濃度與抑菌率關(guān)系Fig.2 The disinfection performance of EGCG-Cu and EGCG

2.3 反應(yīng)時間對EGCG-Cu和EGCG抑菌性能的影響

EGCG-Cu和EGCG在初始24 h的抑菌率見圖3和圖4。

由圖3可知，在0～6 h內(nèi)，EGCG-Cu的消毒效果受接觸時間的影響顯著，在12 h左右達(dá)到最大值并且趨于平穩(wěn)。低初始濃度的EGCG-Cu的抑菌能力受反應(yīng)時間的影響較大，如初始濃度在25 mg/L時，15 min至6 h內(nèi)，其抑菌率增加了60%。而隨著EGCG-Cu的初始濃度的提高，如100 mg/L時，由于EGCG-Cu在15 min時就達(dá)到了84%的抑菌率，所以在15 min至6 h內(nèi)其抑菌率僅增加了9%。綜上所論，EGCG-Cu在初始濃度為100 mg/L時，在較短時間(15 min)就能到達(dá)較好的抑菌效果。在較低初始濃度25 mg/L時，雖短時間(15 min)的抑菌率僅為14%，但隨著反應(yīng)時間的增長，在6 h時能達(dá)到74%的抑菌效果并趨于穩(wěn)定。對比EGCG的抑菌過程，由圖4可知，EGCG-Cu和EGCG均是在6 h左右達(dá)到較穩(wěn)定的抑菌效果，而且在達(dá)到較好的抑菌率的同時，EGCG-Cu的投加量遠(yuǎn)小于EGCG的投加量。

圖3 EGCG-Cu在初始24 h的消毒效果Fig.3 Bacteriostatic rate of EGCG-Cu in the initial 24 h

圖4 EGCG在初始24 h的消毒效果Fig.4 Bacteriostatic rate of EGCG in the initial 24 h

2.4 EGCG與EGCG-Cu誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧簇情況的比較

圖5 EGCG和EGCG-Cu誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生活性氧簇量Fig.5 EGCG and EGCG-Cu induce E.coli to produce ROS

3 結(jié)論

以大腸桿菌作為細(xì)菌滅活效果的指示菌，探究了EGCG-Cu和EGCG的消毒效果，并對初始投加量、反應(yīng)時間等影響因素進(jìn)行了研究，并對EGCG-Cu消毒效果優(yōu)于EGCG的成因進(jìn)行了初探，所得結(jié)論如下：

(1)實驗表明EGCG-Cu的最小抑菌濃度小于EGCG，抑菌性優(yōu)于EGCG。

(2)EGCG-Cu和EGCG的消毒效果均與其初始投加量呈正相關(guān)。在抑菌過程中，EGCG-Cu和EGCG均是在反應(yīng)6 h時達(dá)到較穩(wěn)定的抑菌效果。

(3)相同的消毒效果所需EGCG-Cu或EGCG的投加量不同，EGCG-Cu的投加量遠(yuǎn)小于EGCG。

(4)對EGCG-Cu和EGCG的抑菌機(jī)理分析表明，EGCG-Cu與EGCG相比，在消毒過程中可持續(xù)引起大腸桿菌胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧簇，使菌體的抗氧化系統(tǒng)崩潰，造成菌體死亡。這個過程開始階段主要是EGCG-Cu釋放出的Cu2+發(fā)生類芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生的超氧化物。Cu2+降低后促進(jìn)發(fā)生鏈反應(yīng)起主要作用，發(fā)生氧化反應(yīng)生成EGCG醌和·O2-，持續(xù)使大腸桿菌體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的殺菌效果。

綜上表明，與金屬離子絡(luò)合是改進(jìn)EGCG消毒效果的有效途徑，EGCG-Cu在用量少和消毒效果好方面均體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。