活源方對(duì)CAG大鼠胃黏膜TLR4信號(hào)通路表達(dá)的影響

夏鵬飛，丁 念，梁 金，張覺(jué)人

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430014)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis CAG)是一種消化系統(tǒng)常見(jiàn)病，是以胃黏膜及腺體萎縮為主要表現(xiàn)的胃部炎癥反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究表明，年齡、Hp感染、膽汁反流、生活、飲食習(xí)慣、精神等多種因素對(duì)CAG的發(fā)生有不同程度的影響。慢性萎縮性胃炎在中醫(yī)學(xué)中屬痞滿、胃脘痛、嘈雜等范疇。關(guān)于這一疾病的表現(xiàn)在古籍中早有記載，如《靈樞·邪氣臟腑病形》載：“胃病者，腹脹，胃脘當(dāng)心而痛。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病發(fā)病多與飲食不節(jié)、脾胃虛弱、勞倦太過(guò)、情志不暢以及先天稟賦等有關(guān)。CAG以腺體萎縮為主要表現(xiàn)，目前發(fā)病機(jī)制尚未明確。但CAG可經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期慢性、多階段演變過(guò)程逐漸進(jìn)展為胃癌，因此，CAG被認(rèn)為是(早期)胃癌前病變，對(duì) CAG的早期預(yù)防以及治療至關(guān)重要。隨著時(shí)代的發(fā)展，物質(zhì)充足、快節(jié)奏的生活方式，導(dǎo)致人們飲食、作息不規(guī)律，導(dǎo)致CAG患者越來(lái)越多。目前，西醫(yī)對(duì)于CAG尚無(wú)根治方法，主要采用弱酸治療、抗幽門(mén)螺桿菌等對(duì)癥治療，但因此病病程長(zhǎng)、易反復(fù)、難治愈、易癌變，加之Hp逐漸增強(qiáng)的耐藥性，故常規(guī)治療具有一定的局限性[1]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)春片對(duì)胃黏膜再生有促進(jìn)作用，能夠使病變血液循環(huán)得到改善，有效消除炎癥，提升血清胃泌素、胃動(dòng)素水平，從而達(dá)到治療目的[2]。本研究通過(guò)建立CAG大鼠模型，觀察“活源方”對(duì)大鼠胃黏膜病理、血清TNF-α、IL-6含量及TLR4信號(hào)通路表達(dá)的影響，評(píng)估活源方治療慢性萎縮性胃炎的療效，為防治慢性萎縮性胃炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 活源方顆粒劑組成：木香、砂仁、石斛、沙參、黨參、白術(shù)、薏苡仁、佛手、麥芽、丹參、百花蛇舌草、莪術(shù)、甘草(按比例9∶9∶10∶30∶12∶9∶30∶10∶15∶10∶15∶5∶8配制，由武漢市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供)；胃復(fù)春(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040003，杭州胡慶余堂生產(chǎn))；TNF-α、IL-6、TLR4的ELISA試劑盒(武漢英顥科技有限公司提供)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)12周齡雄性CAG大鼠 120只，體重(200±10)g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0006，實(shí)驗(yàn)在武漢市中醫(yī)藥研究所國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 模型制作參照第二軍醫(yī)大學(xué)李兆申等[3]及中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所陳小野[4]的方法改進(jìn)，進(jìn)行綜合法造模，方法如下：所有大鼠均以0.2%的脫氧膽酸鈉溶液灌胃，用量為1.5 mL/d，與脫氧膽酸鈉溶液灌胃間隔5 h，再用50 ℃熱水2 mL/d灌胃，并且加用饑飽失常(單日禁食禁水，雙日給予足量食水)和勞倦過(guò)度(后4周起，將大鼠每日置于溫水中游泳10 min)，連續(xù)造模12周后，隨機(jī)抽取3只大鼠，麻醉后剖腹取胃，切片并在光鏡下觀察，確定大鼠造模成功。

1.2.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)病理確診，慢性萎縮性胃炎的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》(2002年版)：①固有腺體萎縮；②黏膜肌層增厚；③可有腸上皮化生或假幽門(mén)腺上化生；④固有膜炎癥；⑤可有淋巴濾泡形成。

1.2.3 動(dòng)物分組 空白對(duì)照組(不造模+生理鹽水灌胃)；模型對(duì)照組(造模+生理鹽水灌胃)；陽(yáng)性對(duì)照組(造模+胃復(fù)春水溶液灌胃)；活源方低劑量組(造模+活源方低劑量灌胃)；活源方中劑量組(造模+活源方中劑量灌胃)；活源方高劑量組(造模+活源方高劑量灌胃)；每組20只。

1.2.4 給藥方法 空白對(duì)照組不造模，每只大鼠灌服生理鹽水2 mL/d；模型對(duì)照組造模后，每只大鼠灌服生理鹽水2 mL/d；胃復(fù)春組造模后，每只大鼠灌服胃復(fù)春水溶液，劑量為144 mg/kg；活源方低、中、高組造模后，連續(xù)用活源方顆粒劑灌胃，分別給與6 mL/d、10 mL/d、14 mL/d給大鼠灌胃。30 d為1個(gè)療程，共進(jìn)行2個(gè)療程，各組在第60天結(jié)束后禁食12 h，斷頭取血、取胃后，處死。

2 觀察指標(biāo)

2.1 一般狀態(tài)

在實(shí)驗(yàn)期間，分別于造模成功后給藥的第1天、第30天、第60天稱量并記錄各組大鼠體重。對(duì)各組大鼠的體重、毛色、精神狀態(tài)、食欲、大便及活動(dòng)情況進(jìn)行觀察。

2.1.1 胃黏膜組織學(xué)肉眼觀察 給藥第60天結(jié)束后禁食 12 h，大鼠斷頭取血，各組大鼠處死后，剖取全胃，沿胃大彎側(cè)打開(kāi)，生理鹽水沖洗，平鋪，觀察胃體、胃黏膜皺襞形態(tài)改變、胃黏膜色澤，以及出血點(diǎn)情況及糜爛和潰瘍情況。

2.1.2 肉眼及病理療效評(píng)定 參考國(guó)家中醫(yī)藥管理局的《24個(gè)專業(yè)105個(gè)病種中醫(yī)診療方案》：肉眼胃黏膜療效評(píng)定：分別對(duì)肉眼下紅斑、糜爛、出血、花斑、蒼白、血管顯露、黏膜結(jié)節(jié)等情況加以統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各單個(gè)肉眼所見(jiàn)改善等級(jí)及總積分改善程度：①痊愈：胃黏膜恢復(fù)正常；②顯效：胃黏膜病變積分減少2級(jí)以上；③有效：胃黏膜病變積分減少1級(jí)；④無(wú)效：胃黏膜病變無(wú)改變或加重。

2.1.3 血清中TNF-α、IL-6、TLR4含量 各組大鼠斷頭取血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各項(xiàng)數(shù)據(jù)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

2.2 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

空白對(duì)照組體重基本無(wú)明顯變化，毛色光澤、精神好、活潑好動(dòng)、食欲佳、大便正常。模型組體重逐漸減輕，形體消瘦，毛色枯槁無(wú)光澤、精神萎靡、昏昏欲睡、食欲差、大便溏稀。胃復(fù)春組體重逐漸增加、毛色光澤、精神狀態(tài)良好、食欲良好、大便正常?；钤捶浇M體重逐漸增加、毛色光澤、精神狀態(tài)良好、食欲良好、大便正常。

3.2 胃黏膜組織學(xué)肉眼觀察

空白組大鼠胃黏膜呈粉紅色，皺襞整齊，厚度適中，未見(jiàn)明顯出血點(diǎn)，彈性良好。模型組大鼠胃黏膜呈灰白色，皺襞低平紊亂，厚度變薄，可見(jiàn)散在出血點(diǎn)，彈性差。胃復(fù)春組及活源方各劑量組胃黏膜色澤、形態(tài)及彈性度均出現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)，其中以活源方高劑量組改善最為明顯。各組大鼠胃黏膜情況，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠胃黏膜組織學(xué)肉眼觀察

3.3 肉眼及病理療效評(píng)定

依據(jù)上述療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組，活源方低、中、高劑量組進(jìn)行療效評(píng)定，計(jì)算出總有效率。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠總數(shù)20只，其中治療痊愈3例、顯效10例、有效5例、無(wú)效2例，有效率90%。低劑量治療組大鼠總數(shù)20只，治療痊愈2例、顯效8例、有效6例、無(wú)效4例，有效率80%；中劑量治療組大鼠總數(shù)20只，治療痊愈3例、顯效11例、有效4例、無(wú)效2例，有效率90%；高劑量治療組大鼠總數(shù)20只，治療痊愈6例、顯效11例、有效2例、無(wú)效1例，有效率95%。由此可見(jiàn)，治療組病理組織學(xué)總有效率高于對(duì)照組(P<0.05)。

3.4 血清TNF-α、IL-6含量

各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量指標(biāo)變化情況，見(jiàn)表2。

組別TNF-αIL-6空白組14.08±0.5435.24±3.15模型組32.10±0.321)51.45±2.921)陽(yáng)性對(duì)照組21.13±0.4143.58±3.12低劑量治療組25.13±0.232,3)45.67±1.562,3)中劑量治療組24.62±0.252,3)45.36±1.932,3)高劑量治療組22.46±0.362,3)44.05±2.532,3)

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3)P>0.05。

結(jié)果表明，模型組與空白組血清TNF-α、IL-6含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與模型組血清TNF-α、IL-6含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與陽(yáng)性對(duì)照組血清TNF-α、IL-6含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

3.5 TLR4信號(hào)通路表達(dá)

各組大鼠胃黏膜組織TLR4比較，見(jiàn)表3。

組別TLR4空白組0.61±0.13模型組1.16±0.151)陽(yáng)性對(duì)照組0.91±0.17低劑量治療組1.04±0.122,3)中劑量治療組0.95±0.232,3)高劑量治療組0.89±0.162,3)

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，3)P>0.05。

結(jié)果表明，模型組與空白組血清TLR4含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與模型組血清TLR4含量有明顯差異(P<0.05)；活源方各治療組與陽(yáng)性對(duì)照組血清TLR4含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。

4 討論

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是人類免疫系統(tǒng)中重要的膜受體，目前被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞的跨膜蛋白[5]。TLRs可識(shí)別病原相關(guān)的外源性配體及某些內(nèi)源性配體。在TLRs家族成員中，與CAG發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切的是TLR4。在受到配體刺激的情況下可傳遞炎癥信號(hào)，并導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子釋放[6]。血清IL-6、TNF-α是常用于評(píng)估胃黏膜損傷嚴(yán)重程度的促炎細(xì)胞因子，以上指標(biāo)數(shù)值的變化對(duì)評(píng)估治療慢性萎縮性胃炎的療效具有重要參考意義。在實(shí)驗(yàn)中，模型組TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達(dá)升高，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);活源方各治療組與模型組比較，活源方各治療組血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達(dá)均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明大鼠胃黏膜受到損傷后，機(jī)體產(chǎn)生了一系列反應(yīng)，給藥治療后，陽(yáng)性對(duì)照組和活源方各治療組均能糾正這些指標(biāo)，表明活源方能調(diào)整機(jī)體出現(xiàn)的紊亂，修復(fù)損傷的胃黏膜，達(dá)到治療慢性萎縮性胃炎的效果。

活源方由木香、砂仁、石斛、沙參、黨參、白術(shù)、薏苡仁、佛手、麥芽、丹參、百花蛇舌草、莪術(shù)、甘草組成，各類中藥相互作用、相輔相成，共同調(diào)理脾胃氣機(jī)，改善脾胃功能。其中木香味辛、性溫，歸脾、大腸、三焦經(jīng)，主行氣、止痛、健脾消食，可促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、調(diào)整胃腸動(dòng)力以鎮(zhèn)痛[7]。砂仁味辛、性溫，歸脾、胃、腎經(jīng)，主化濕開(kāi)胃、溫脾止瀉、鎮(zhèn)痛消炎，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)，同時(shí)可以抑制胃蛋白和胃潰瘍中酶抑制導(dǎo)致的胃黏膜細(xì)胞障礙、急性胃黏膜損傷等胃潰瘍癥狀[8]。石斛性味甘淡微咸，寒，歸胃、腎、肺經(jīng)，可益胃生津、滋陰清熱。石斛能明顯刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-2及干擾素-γ的活性，具有抗炎、免疫作用[9]。沙參甘而微苦，有滋補(bǔ)作用。黨參性甘，補(bǔ)中益氣，和胃生津。黨參中分離得出的菊糖型果聚糖CP-A對(duì)乙醇所致的急性胃潰瘍模型大鼠3級(jí)胃黏膜損傷、高潰瘍指數(shù)及胃黏膜出血損傷有顯著改善作用[10]。白術(shù)、丹參有止痛之效，白術(shù)能調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，修復(fù)胃腸道黏膜損傷，并有抗炎等作用[11]。薏苡仁味甘、淡，性涼，利水滲透濕，健脾止瀉。佛手有止痛和胃、燥濕化痰的功效，能增強(qiáng)體質(zhì)、提高免疫機(jī)能[12]。麥芽行氣消食，健脾開(kāi)胃。百花蛇舌草、莪術(shù)有抗菌消炎、抗腫瘤作用。甘草味甘，性平，可補(bǔ)脾益氣，調(diào)和諸藥。

近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，長(zhǎng)期服用中藥湯劑，能改善胃黏膜病變，從而改善慢性萎縮性胃炎癥狀[13-15]。本研究中的活源方作為一個(gè)新型藥方，可健脾和胃、調(diào)氣養(yǎng)陰、化瘀解毒，藥物配伍嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)治療后，活源方各治療組血清TNF-α、IL-6、TLR4蛋白表達(dá)均有下降，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明活源方可促進(jìn)胃黏膜損傷恢復(fù)，對(duì)治療慢性萎縮性胃炎有良好的療效。