菠菜子水提取物的抗炎活性及急性毒性實驗研究

劉鴻雁，李 波*，郝寶成，姜?；瑒?淵，梁 云

(1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

菠菜來源于藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL.，又稱菠薐，既作蔬菜用，又可入藥，其入藥始載于《食療本草》，屬藥食同源類植物，具有利五臟、通腸胃熱、解酒毒功效[1-2]。菠菜子是菠菜的果實，又稱菠薐菜子，具有清肝明目、止咳平喘之效，主治風(fēng)火目赤腫痛、咳喘[3-4]。藥理研究表明菠菜提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗高血脂和降糖等活性[4-5]。菠菜在我國作為蔬菜有著悠久的栽培和食用歷史，在長期的食用過程中發(fā)現(xiàn)菠菜和菠菜子具有藥用屬性，菠菜和菠菜子作為蔬菜國內(nèi)外已有大量研究，作為藥用，古代本草學(xué)對其功效和使用方法等亦有大量記載，但對其現(xiàn)代藥學(xué)的系統(tǒng)性研究較少，尤其是菠菜子屬于民間習(xí)用藥材，其藥理作用雖有一定研究基礎(chǔ)，但不夠系統(tǒng)和深入，導(dǎo)致其藥用資源開發(fā)和臨床應(yīng)用受限。目前，隨著對菠菜子藥食同源開發(fā)利用的增多，應(yīng)對其作用機(jī)理及藥效進(jìn)行研究，為菠菜子的臨床合理應(yīng)用和藥材資源開發(fā)提供實驗依據(jù)[6]。

中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，有著悠久的應(yīng)用和發(fā)展史。中藥材來源受地域和古代認(rèn)識水平所限，同一藥材的基原、產(chǎn)地加工和藥用部位往往在不同時期有不同的變化。目前，隨著科技的發(fā)展和對中藥研究的深入，中藥的毒性越來越受到重視，近年來很多臨床實踐和研究發(fā)現(xiàn)，由于對中藥材基原、炮制加工等認(rèn)識欠缺，造成臨床使用不當(dāng)，導(dǎo)致中藥在臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)事件頻發(fā)，對中藥的安全用藥和臨床使用造成很大影響。菠菜和菠菜子來源于同一植物的不同藥用部位[6]，菠菜子屬于古代傳統(tǒng)和民間習(xí)用藥材，故對其進(jìn)行初步安全性研究，以期為菠菜子的安全性和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

SPF級昆明小鼠：體重(20±2)g，雌雄各半，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001)。SPF級SD大鼠：體重(120±2)g，雄性，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK(甘)2015-0001)。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級別。飼養(yǎng)方法：按組分籠飼養(yǎng)，小鼠每籠6只，自由進(jìn)食進(jìn)水；小鼠每籠5只，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 藥品和器材

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，批號：20180411，精確度0.000 1 g)；一次性使用無菌注射器(2 mL，鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)許可證：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20010222號)；二甲苯(天津市百世化工有限公司，批號：50180715)；水合氯醛(鄭州市德眾化學(xué)試劑廠，批號：20190315)；二甲苯(鄭州市德眾化學(xué)試劑廠，批號：20190315)；阿司匹林腸溶片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號：286190163)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：170794)；菠菜子水提取物(蘭州市肺科醫(yī)院提供)；打孔器；棉球。

2 試驗方法

2.1 對二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響

取SPF級昆明小鼠60只，隨機(jī)分為溶媒對照組、阿司匹林組0.30 g/kg、菠菜子水提取物0.75、1.50、3.00 g/kg劑量組，每組12只，雌雄各半，各組均以20 mL/kg灌胃給藥，溶媒對照組給與等體積超純水，1次/d，連續(xù)6 d。末次給藥后45 min，各組小鼠于右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.05 mL，左耳不涂為對照。致炎后1 h頸椎脫臼處死小鼠，用直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，取耳片于分析天平稱重，按下式計算耳腫脹度及抑制率：

腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

抑制率=(溶媒組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/溶媒組平均腫脹度×100%

2.2 對大鼠棉球肉芽腫的影響

取SPF級SD大鼠50只，雄性，隨機(jī)分為溶媒對照組、醋酸地塞米松0.15 mg/kg和菠菜子水提取物0.5、1.0和2.0 g/kg劑量組，每組10只。用3.5%的水合氯醛麻醉，頸部剃毛，將2個高溫滅菌的棉球約75 mg植入大鼠雙側(cè)腋窩皮下，手術(shù)線縫合皮膚，注射氨芐青霉素1 mg/0.1 mL抗感染。各組大鼠于手術(shù)后第2天以10 mL/kg體重給藥劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)9 d。末次給藥后1 h，頸椎脫臼處死小鼠，取出棉球，將棉球放入60 ℃烘箱中干燥12 h，稱重，減去原棉球質(zhì)量即為肉芽凈重。

由于所形成的肉芽組織易向棉球纖維內(nèi)浸潤，在剝離肉芽腫組織時應(yīng)小心，否則影響其準(zhǔn)確性。由于棉球的表面積對實驗結(jié)果的影響較大，為了減少差異，植入每只大鼠的棉球形狀和植入部位應(yīng)相似。

2.3 菠菜子水提取物急性毒性試驗

2.3.1 預(yù)實驗 取昆明小鼠40只，隨機(jī)分為溶媒對照組和菠菜子水提取物(最大耐受量組以4的倍數(shù)共計設(shè)置4組：20 000 mg/kg、5 000 mg/kg、1 250 mg/kg、312.5 mg/kg)，每組8只，雌雄各半，連續(xù)觀察7 d，詳細(xì)記錄動物毒性反應(yīng)情況和死亡情況，計算半數(shù)致死量(LD50)的置信區(qū)間。

2.3.2 最大耐受量試驗 取昆明小鼠40只，隨機(jī)分為溶媒對照組和菠菜子水提取物最大耐受量(20 000 mg/kg，濃度1 g/mL)，每組20只，雌雄各半。各組均以0.4 mL/20 g灌胃給藥，給藥后2 h、4 h連續(xù)觀察小鼠有無毒性反應(yīng)及死亡情況，連續(xù)觀察7 d，主要觀察小鼠飲食、外觀、行為活動、分泌物、排泄物等是否有異常，死亡情況，中毒反應(yīng)癥狀及起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間、是否可逆及恢復(fù)時間等。分別于0 d、7 d稱重。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死存活小鼠，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器有無異常及明顯病變。

3 結(jié)果與分析

3.1 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時用LSD檢驗，兩兩比較方差不齊時用Tamhane檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 對二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響

本實驗結(jié)果顯示，菠菜子水提取物能抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，抑制率分別為低劑量組25.62%，中劑量組7.17%，高劑量組48.10%。菠菜子水提取物低劑量組和中劑量組與溶媒對照組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義，且各劑量組未表現(xiàn)出劑量依賴性，其中，菠菜子水提取物高劑量組與溶媒對照組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示菠菜子水提取物高劑量組具有抗炎、消腫作用，其抗炎機(jī)制需進(jìn)一步研究。與阿司匹林陽性組比較，菠菜子水提取物各劑量組均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示菠菜子水提取物各劑量組的抗炎消腫作用與陽性藥阿司匹林組相當(dāng)，見表1。

組別n劑量(g/kg)腫脹度(mg)抑制率(%)溶媒對照組12-7.6750±2.83681-阿司匹林陽性組120.306.1417±2.5393119.90菠菜子低劑量組120.755.7083±3.5287025.62菠菜子中劑量組121.507.1250±2.412897.17菠菜子高劑量組123.003.9833±2.07050?48.10

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05。

3.3 對大鼠棉球肉芽腫的影響

直觀分析發(fā)現(xiàn)：各劑量組對大鼠棉球肉芽腫的影響為高劑量組>中劑量組>低劑量組，但各劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。菠菜子水提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組與溶媒對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且各劑量組未表現(xiàn)出劑量依賴性。與醋酸地塞米松陽性組比較，菠菜子水提取物各劑量組的抑制作用相當(dāng)(P>0.05)，見表2。

組別n劑量(mg/kg)肉芽比率(%)溶媒對照組10-2.9258±2.1674醋酸地塞米松陽性組100.152.5012±1.600菠菜子水提取物低劑量組105003.5010±1.1282菠菜子水提取物中劑量組1010002.5401±1.7836菠菜子水提取物高劑量組1020002.3489±0.8656

注：與溶媒對照組比較，*P<0.05。

3.4 菠菜子水提取物急性毒性預(yù)試驗

實驗期內(nèi)各劑量組小鼠無死亡發(fā)生，小鼠精神狀態(tài)良好，未觀察到明顯中毒現(xiàn)象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見明顯病變及異常。

通過對各組小鼠的體重變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明各組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見表3。

組別性別體重0d7d溶媒對照組♂20.73±0.8122.56±2.27♀21.49±0.4634.24±3.29312.5mg/kg組♂20.42±1.2923.92±1.27♀20.96±1.3933.27±1.621250mg/kg組♂21.09±0.2522.30±0.19♀21.33±0.7333.43±1.895000mg/kg組♂21.05±0.9624.11±2.24♀19.67±1.3432.75±2.7920000mg/kg組♂20.01±0.7222.64±0.73♀21.19±0.5634.04±2.16

3.5 最大耐受量試驗

實驗結(jié)果顯示：實驗期內(nèi)各劑量組小鼠無死亡發(fā)生，小鼠精神狀態(tài)良好，未觀察到明顯中毒現(xiàn)象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見明顯病變及異常。

通過對兩組小鼠的體重變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明最大耐受組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見表4。

組別性別體重0d7d溶媒對照組♂21.18±0.9728.66±5.49♀21.45±0.3932.15±2.87最大耐受組♂21.02±0.6129.73±6.55♀21.41±0.5728.84±1.91

4 討論

本試驗依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]《中藥制劑的急性毒性試驗》[8]對菠菜子水提取物小鼠急性毒性進(jìn)行了實驗研究，并對菠菜子水提物的安全性進(jìn)行了初步評價。結(jié)果顯示：給藥組小鼠在各自劑量下均未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，也無死亡發(fā)生，尸檢未發(fā)現(xiàn)各臟器異常。給藥組小鼠的體重增長與溶媒對照組相比無顯著性差異。小鼠在20 000 mg/kg體重的劑量下沒有產(chǎn)生毒性作用，根據(jù)中藥毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)可確定為實際無毒。本試驗未能測出該制劑的LD50，實驗結(jié)果顯示小鼠對菠菜子水提取物的最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)為20 000 mg/kg體重，且沒有產(chǎn)生毒性作用，根據(jù)中藥毒性的分級標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為菠菜子安全性較好，但由于本研究采用的是水提物，對于菠菜子中其他有效化學(xué)成分或有效部位的安全性還需做進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

炎癥是機(jī)體受到外傷、感染等損傷因子的刺激產(chǎn)生的一種以防御為主，損傷與抗損傷并存的基本病理過程。炎癥通常會改變機(jī)體的正常生理指標(biāo)，誘發(fā)多種急、慢性炎癥疾病，并使含血管系統(tǒng)的生物機(jī)體產(chǎn)生復(fù)制的防御反應(yīng)，炎癥是一種病理過程，早期(急性炎癥)主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫，中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細(xì)胞游走，晚期為肉芽組織增生。二甲苯所致小鼠耳廓腫脹是研究急性炎癥常用的模型，而大鼠棉球肉芽腫實驗是研究慢性炎癥常用的模型。本實驗從不同炎癥發(fā)展的不同階段選取了兩種模型進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗炎模型中隨著藥物濃度增加，藥效未相應(yīng)增加，說明藥物效應(yīng)達(dá)到飽和的程度后，再繼續(xù)增加藥物濃度，其效應(yīng)不會再增加，即菠菜子水提取物可能是一種時間依賴性的物質(zhì)，決定療效的重要因素取決于時間。綜上，菠菜子水提取物具有良好的抗炎活性且安全無毒，在防治急慢性炎癥、腹腔感染性疾病等方面具有很大的開發(fā)價值。目前，菠菜子的應(yīng)用受限，今后應(yīng)系統(tǒng)研究其安全性和有效性，需從多途徑多通路入手，包括HPAA系統(tǒng)、花生四烯酸代謝系統(tǒng)、炎癥因子、抗血栓、氧自由基清除等方面，在分子水平上探討其抗炎作用機(jī)制，為菠菜子的臨床合理應(yīng)用及資源開發(fā)提供依據(jù)。