兒童朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥BRAFV600E突變對預(yù)后的影響

崔 蕾 張 莉 廉紅云 王一卓 武萬水 王天有 李志剛 張 蕊

朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(LCH)是一類以朗格罕細(xì)胞異?？寺⌒栽錾途奂?dǎo)致組織損傷為特點的組織細(xì)胞疾病，好發(fā)于幼年兒童[1]，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，輕者表現(xiàn)為自限性的單純骨或皮膚損害，重者可累及多個危險器官甚至危及生命[2]。目前主要采用聯(lián)合化療治療LCH，患兒對化療的反應(yīng)和預(yù)后有很大差異，治療過程中容易復(fù)發(fā)，還可能遺留尿崩癥、肝硬化、神經(jīng)元退行性變等終生后遺癥，屬于兒科血液系統(tǒng)疑難罕見病之一[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，50%～65%的LCH患者中存在B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(BRAF)的V600E突變(BRAFV600E)[4,5]。BRAFV600E突變在LCH預(yù)后中的意義尚存爭議。本研究在LCH患兒中探討了BRAFV600E突變與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，并分析影響兒童LCH的預(yù)后因素。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 回顧性納入首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)收治的LCH患兒，對患兒病灶組織進(jìn)行BRAFV600E突變檢測，分析BRAFV600E突變與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，單因素和多因素分析影響兒童LCH預(yù)后的因素。

1.2 倫理 本研究方案獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會的審批(2020-k-16)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 同時滿足以下標(biāo)準(zhǔn)時納入：①2016年1月1日至2017年12月31日我院收治的LCH患兒，病灶活檢病理免疫組化染色CD1a陽性和/或CD207陽性；②年齡<18歲；③病灶組織進(jìn)行了BRAFV600E突變檢測；④取得患兒(8歲以上)及監(jiān)護(hù)人同意，并簽署書面知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 滿足以下任一項者排除：①確診后未按照我院規(guī)范化診療方案進(jìn)行系統(tǒng)化療；②入我院前接受過抗腫瘤治療。

1.5BRAFV600E突變檢測 采用數(shù)字PCR方法檢測病灶組織中的BRAFV600E突變。采集患兒診斷時病灶活檢組織石蠟包埋的10 μm×5 μm未染色切片，采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(Qiagen, Netherlands)提取基因組DNA，儲存于-80 ℃冰箱待用。采用QX200TM液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)檢測，引物和探針序列如下(5’-3’)，正向引物：CATGAAGACCTCACAGTAAAAATAG-GTGAT，反向引物：TGGGACCCACTCCATCGA，野生型探針(HEX標(biāo)記)：CTAGCTACAGTGAAATC，突變型探針(FAM標(biāo)記)：TAGCTACAGAGAAATC。20 μL反應(yīng)體系包括：1×dd PCR Supermix for Probes(No dUTP, Bio-Rad), 250 nM探針和900 nM引物及DNA模板12 ng。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，然后95℃ 50 s和58℃ 90 s，共40個循環(huán)，最后70℃ 5 min。結(jié)果采用Quantasoft分析軟件(Bio-Rad)分析。陽性對照采用Tru-Q7(1.3% Tier)參考標(biāo)準(zhǔn)DNA(Horizon Discovery, Lafayette, USA)，陰性對照經(jīng)過知情同意后采用健康志愿者外周血基因組DNA。所有樣本重復(fù)檢測3次。檢測敏感度為0.1%。

1.6 疾病分型 LCH根據(jù)受累器官/系統(tǒng)分為單系統(tǒng)型(SS)和多系統(tǒng)型(MS)，MS-LCH根據(jù)有無“危險器官”(肝、脾、造血系統(tǒng))受累分為無“危險器官”受累(MS RO-)和有“危險器官”受累(MS RO+)[6]。

1.7 治療方案 采用我院BCH-LCH-2014方案，主要參考國際組織細(xì)胞協(xié)會LCH-Ⅲ和LCH-S-2005方案[7,8]。分層治療方案如下。①一線治療：潑尼松和長春新堿，每療程6周，1或2個療程；②二線治療：阿糖胞苷和/或克拉屈濱、潑尼松和長春新堿，每療程4周，共4或8個療程；③維持治療：潑尼松、長春新堿(SS和MS RO-)，潑尼松、長春新堿和6-巰基嘌呤(MS RO+)；總療程半年或1年，具體治療方案見參考文獻(xiàn)[9]。

1.8 疾病狀態(tài)評定 患兒在治療前、一線治療第6周、12周、25周、52周、二線治療第4療程、第8療程末進(jìn)行評估，維持治療每3個月評估1次，評估內(nèi)容包括病史、體格檢查、實驗室檢查(血常規(guī)、生化、尿滲透濃度及內(nèi)分泌檢查等)和受累部位的影像學(xué)檢查等。①疾病無活動(NAD)：即痊愈，所有癥狀和體征完全消退，影像學(xué)檢查恢復(fù)正常；②疾病活動(AD)：好轉(zhuǎn)，即部分病灶好轉(zhuǎn)，沒有病灶加重或新發(fā)病灶；③混合：部分病灶好轉(zhuǎn)，部分加重或出現(xiàn)新發(fā)病灶；④穩(wěn)定：原有病灶無好轉(zhuǎn)或加重，無新發(fā)病灶；⑤進(jìn)展：原有病變進(jìn)展和/或出現(xiàn)新發(fā)病灶；⑥復(fù)發(fā)(再激活)：為患兒獲得痊愈或維持治療3個月以上持續(xù)好轉(zhuǎn)后再次出現(xiàn)新發(fā)病灶。治療反應(yīng)分為良好(包括NAD、好轉(zhuǎn))、中等(穩(wěn)定、混合)和不良(進(jìn)展、復(fù)發(fā))[8]。一線治療第6周反應(yīng)率指治療反應(yīng)為良好的比例。

1.9 隨訪

1.9.1 隨訪內(nèi)容 患兒停藥后3個月、6個月、1年、2年、3年和5年分別進(jìn)行隨訪。隨訪內(nèi)容包括生存情況、疾病狀態(tài)評定和不良事件(進(jìn)展、復(fù)發(fā)、后遺癥、死亡)發(fā)生。本研究隨訪截至2019年12月31日。

1.9.2 事件評估 ①無進(jìn)展生存(PFS)：由診斷之日至出現(xiàn)進(jìn)展或復(fù)發(fā)或死亡之日。②無事件生存(EFS)：由診斷之日至發(fā)生事件(進(jìn)展、復(fù)發(fā)、持續(xù)性后遺癥或死亡)之日。③總生存(OS)：由確診之日至各種原因?qū)е碌乃劳鲋铡?/p>

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用IBM SPSS 25.0軟件包(IBM Corporation，Armonk, NY, USA)進(jìn)行分析。采用精確概率法χ2檢驗比較BRAFV600E突變陽性組和陰性組在臨床特征方面的差異。兩組連續(xù)變量如年齡的比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗。采用Kaplan-Meier法分析生存率，Log-Rank檢驗比較各組間生存率差異，Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素的預(yù)后分析，Cox回歸分析模型進(jìn)行多因素分析。檢驗顯著性取α=0.05，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間我院共收治250例LCH患兒，排除無足夠的病灶組織行BRAFV600E突變檢測88例、確診后未按照我院規(guī)范化診療方案進(jìn)行系統(tǒng)化療17例、入我院前接受過其他抗腫瘤治療5例，最終140例患兒納入本文分析。140例患兒中BRAFV600E突變陽性率為67.1%(94例)。臨床分型為SS 60例(42.9%)，MS RO-47例(33.6%)，MS RO+33例(23.6%)。表1顯示，診斷時中位年齡為2.2(0.1～15.7)歲，男89例(63.6%)，女51例。受累部位最常見為骨，其次為危險器官、皮膚、耳、肺、眼部、垂體、淋巴結(jié)、口腔、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、副鼻竇、胃腸道、縱膈、甲狀腺和腮腺。危險器官以肝受累最常見，其次為脾和骨髓。110例患兒首先進(jìn)行了一線治療，并在第6周進(jìn)行治療反應(yīng)評估，總體第6周反應(yīng)率為42.7% (47/110)。

表1 140例兒童朗格漢細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥不同臨床特征中BRAFV600E突變的陽性率比較[n(%)]

中位隨訪時間34.1(0.9～50.7)月，隨訪期內(nèi)48例(34.3%)出現(xiàn)進(jìn)展；40例(28.6%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)；12例(9.6%)出現(xiàn)持續(xù)性后遺癥，其中9例尿崩癥、2例肝硬化、1例雙側(cè)腦室脫髓鞘病變；死亡3例(2.1%)，其中1例因合并重癥肺炎、縱膈氣腫、呼吸衰竭死亡，1例因肝硬化、門靜脈高壓、多臟器衰竭死亡，1例因繼發(fā)噬血細(xì)胞綜合征和重癥感染死亡。總體3年P(guān)FS、EFS和OS分別為(48.9%±4.5%)、(46.6%±4.4%)和(97.8%±1.2%)。

2.2BRAFV600E突變與臨床特征的相關(guān)性 表1顯示，BRAFV600E突變與患兒臨床分型相關(guān)，MS RO+患兒突變陽性率(90.9%)高于MS RO-(53.2%)或SS患兒(65.0%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；危險器官肝、脾、骨髓受累患兒的陽性率高于非危險器官受累患兒；皮膚受累患兒的陽性率改與非皮膚受累患兒，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3BRAFV600E突變與預(yù)后的相關(guān)性 表1顯示，BRAFV600E突變與患兒的進(jìn)展/復(fù)發(fā)相關(guān)，突變陽性患兒進(jìn)展/復(fù)發(fā)率(57.4%)高于突變陰性患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，后遺癥和死亡的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1顯示，3種臨床分型患兒的預(yù)后(3年P(guān)FS、EFS和OS)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A～C)。進(jìn)一步分析每種臨床分型中BRAFV600E突變的預(yù)后，BRAFV600E突變陽性和陰性患兒的預(yù)后差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D～J)。

圖1 兒童朗格漢細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥中BRAFV600E突變陽性和陰性患兒的預(yù)后比較注 A:不同臨床分型:[單系統(tǒng)組(SS)、多系統(tǒng)無危險器官受累組(MS RO-)和多系統(tǒng)有危險器官受累組(MS RO+)]患兒的3年無進(jìn)展生存(PFS);B:不同臨床分型患兒的3年無事件生存(EFS);C:不同臨床分型患兒的3年總生存(OS);D:SS LCH中突變陽性和陰性患兒的3年P(guān)FS;E:SS LCH中突變陽性和陰性患兒的3年EFS;F:MS RO-LCH中突變陽性和陰性患兒的3年P(guān)FS;G:MS RO-LCH中突變陽性和陰性患兒的3年EFS;H:MS RO+ LCH中突變陽性和陰性患兒的3年P(guān)FS;I:MS RO+ LCH中突變陽性和陰性患兒的3年EFS;J:MS RO+ LCH中突變陽性和陰性患兒的3年OS(因SS和MS RO-組所有患兒的3年OS均為100%,未做突變陽性和陰性患兒的3年OS差異分析)

表2顯示，單因素分析顯示，BRAFV600E突變、診斷時年齡和受累部位(皮膚、危險器官、垂體和耳)是影響兒童LCH預(yù)后的因素。多因素分析結(jié)果顯示，危險器官受累是影響兒童LCH 3年P(guān)FS的獨立預(yù)后因素(HR=2.702，P=0.003)，垂體受累(HR=3.582，P<0.001)、危險器官(HR=2.321，P=0.008)和耳部受累(HR=2.093，P=0.013)是3年EFS的獨立預(yù)后因素。BRAFV600E突變并非兒童LCH的獨立預(yù)后因素(PFS：HR=1.425，P=0.254；EFS：HR=1.721，P=0.077)。

表2 單因素和多因素分析影響兒童朗格罕細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥預(yù)后的因素

注 HR：風(fēng)險比

3 討論

LCH是一類高度異質(zhì)性的罕見疾病，臨床表現(xiàn)和患兒對治療的反應(yīng)差異較大，BRAFV600E突變是兒童LCH中最常見的突變，因此，探討該突變在LCH中的預(yù)后意義對于臨床治療具有重要的指導(dǎo)價值。BRAF基因位于人7號染色體7q34，編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等信號通路中起關(guān)鍵作用，影響細(xì)胞的分裂、分化和分泌等重要生物學(xué)過程[10]。BRAF基因第15號外顯子上的點突變c.1799T>A p.V600E是最常見的突變，多發(fā)生于惡性黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤，并與腫瘤進(jìn)展/復(fù)發(fā)、預(yù)后差密切相關(guān)[11-13]。2010年發(fā)現(xiàn)一半以上LCH患者中存在BRAFV600E突變，改變了對該疾病的認(rèn)識，目前認(rèn)為LCH是一種髓系來源的罕見腫瘤[14,15]。然而，由于疾病的高度異質(zhì)性，該突變在LCH中的預(yù)后意義仍存爭議。

法國一項回顧性研究顯示，315例兒童LCH中BRAFV600E突變陽性率為54.6%，突變與危險器官受累相關(guān)，并且突變陽性患兒對一線治療的反應(yīng)較差，復(fù)發(fā)率和后遺癥發(fā)生率均高于突變陰性患兒[16]。國內(nèi)一項納入65例兒童和32例成人LCH的研究顯示，BRAFV600E突變陽性患者的PFS較差，并且是獨立預(yù)后因素之一(HR=2.38，P=0.044)[17]，然而，該研究中BRAFV600E突變陽性率僅為32.0%，患者臨床分型以SS為主(91.8%)，MS RO+僅為6.1%，與本研究人群的臨床特征有較大差異。在一項肺受累的成人LCH研究中，BRAFV600E突變與進(jìn)展等預(yù)后指標(biāo)并無明顯相關(guān)性[18]。本課題組曾回顧性分析80例兒童LCH，顯示BRAFV600E突變與臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)及復(fù)發(fā)均無明顯相關(guān)性，然而該研究樣本量較小，隨訪時間較短，未行生存率等預(yù)后分析[19]。本研究顯示，BRAFV600E突變與總體患兒的進(jìn)展/復(fù)發(fā)相關(guān)，推測是因為該突變主要發(fā)生在侵襲性較強的高危LCH亞型中，而在多因素分析中，危險器官受累是影響預(yù)后的獨立預(yù)后因素，從而抵消了BRAFV600E突變對預(yù)后的影響。由于LCH疾病的異質(zhì)性和人種的差異，還需要更多大樣本的研究加以明確。

研究顯示，BRAF基因是LCH重要的驅(qū)動基因，并且BRAFV600E突變在不同細(xì)胞中發(fā)生的層級決定了LCH臨床表現(xiàn)的差異[20, 21]；小鼠模型中，在骨髓干祖細(xì)胞表達(dá)BRAFV600E突變可導(dǎo)致人高危型LCH的疾病表現(xiàn)，而在分化成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)中該突變則引起局灶性的LCH病灶[22]。本研究和其他研究都證明，高危難治型LCH中BRAFV600E突變的陽性率高，并且多為小年齡患兒，普遍對一線治療反應(yīng)差，二線治療和補救治療則存在較強的化療不良反應(yīng)[23]。因此，近年來針對BRAF的靶向治療已被嘗試用于這些難治/復(fù)發(fā)患兒，最新一項歐美多中心研究結(jié)果顯示，采用BRAF抑制劑Vemurafenib 治療54例難治性多系統(tǒng)LCH患兒，獲得了較好的短期療效，8周完全反應(yīng)率達(dá)70.4%，然而，仍有80%患兒停藥后出現(xiàn)了復(fù)發(fā)；藥物不良反應(yīng)(主要為皮疹)是可控的，但藥物的最適劑量、療程、長期療效還有待于更多的大樣本、前瞻性的臨床試驗進(jìn)一步明確[24]。由于病灶組織取樣較困難，一些研究通過定量檢測循環(huán)血細(xì)胞或血漿中游離BRAFV600E突變，對LCH進(jìn)行診斷和治療反應(yīng)評估[25, 26]。在組織BRAFV600E突變陽性患兒中，幾乎所有高危LCH血細(xì)胞或血漿中的突變均為陽性，并且與治療反應(yīng)相關(guān)。本課題組研究也證實，診斷時和化療過程中的血漿游離BRAFV600E陽性LCH患兒的PFS較差，易出現(xiàn)進(jìn)展/復(fù)發(fā)，從而為疾病的預(yù)后判斷提供了較好的指標(biāo)[9]。此外，在BRAFV600E突變陰性的LCH患兒中，還發(fā)現(xiàn)存在其他基因的突變?nèi)鏜AP2K1、ARAF、ERBB3等，它們在LCH中的臨床意義還需進(jìn)一步闡明[27, 28]。

綜上所述，本研究對兒童LCH中BRAFV600E突變的臨床意義進(jìn)行了分析，顯示BRAFV600E突變主要發(fā)生在危險器官受累的高危患兒中，與突變陰性患兒相比，突變陽性患兒進(jìn)展/復(fù)發(fā)率增加，但該突變并非是兒童LCH的獨立預(yù)后因素。LCH雖然死亡率較低，但反復(fù)進(jìn)展/復(fù)發(fā)已成為該病治療失敗的主要原因，尤其是對于MS LCH。