大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

張迎春，孫天歌，張小雪，梁其干，李艷軍，孫 杰

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，是制約中國(guó)棉花生產(chǎn)的主要因素之一。中國(guó)棉花黃萎病主要是大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)和黑白輪枝菌(Verticilliumalboatrum)侵染所致。大麗輪枝菌是一種土傳性病原真菌，可侵染200多種植物，其寄主主要是雙子葉植物[1-2]。大麗輪枝菌的微菌核能在土壤中存活30～50年，當(dāng)感應(yīng)到寄主植物根際釋放的根系分泌物后，微菌核開始萌發(fā)產(chǎn)生感染性菌絲可定植于根皮層，進(jìn)而擴(kuò)散到木質(zhì)部產(chǎn)生孢子，導(dǎo)致作物的維管束受到阻塞，出現(xiàn)枯萎癥狀，發(fā)育遲緩，黃化和壞死[3-5]，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。因中國(guó)氣候變化多樣，大麗輪枝菌在不同環(huán)境條件下產(chǎn)生了許多具有豐富遺傳多樣性的生理小種，田間致病性易發(fā)生變異，出現(xiàn)強(qiáng)致病力的類型[6-7]，大麗輪枝菌的防治目前仍無(wú)有效的生物及化學(xué)措施。大麗輪枝菌全基因組數(shù)據(jù)的公布為其致病分子機(jī)制的研究提供了基礎(chǔ)，為抗病新品種的開發(fā)提供了新路線[8]。

植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素以及果膠等多糖組成，這些組分與木質(zhì)素一起形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成植物的支撐結(jié)構(gòu)[9]。在大麗輪枝菌侵染植物過(guò)程中分泌大量的細(xì)胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes, CWDEs)[10]。細(xì)胞壁降解酶不僅可降解植物細(xì)胞壁中的多糖，而且也破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，為病原微生物的入侵和攝取營(yíng)養(yǎng)提供條件[11]。細(xì)胞壁降解酶包括角質(zhì)酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶、果膠裂合酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶G1、β-1,4-葡萄糖苷酶和蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶等[11]。角質(zhì)酶VdCUT11水解植物細(xì)胞壁的角質(zhì)層促進(jìn)大麗輪枝菌的侵染[12]。果膠裂解酶VdPL1可誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)，同時(shí)作為一個(gè)毒力因子參與大麗輪枝菌的侵染[13]。除角質(zhì)酶和果膠裂解酶外，纖維素酶、聚半乳糖醛酸酶、木聚糖酶等在大麗輪枝菌侵染植物的過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[13]。

植物細(xì)胞的感染需要半纖維素的降解[14]，木聚糖是植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分。在蘋果樹爛腐病研究中，木聚糖酶被證明與致病性或毒力有關(guān)[15]。在灰霉病菌研究中，木聚糖酶基因xyn11A缺失突變體的致病力顯著降低，但未完全喪失致病力[16]。木聚糖酶屬于水解酶類，主要包括有β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等[17]。其中，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶是使木聚糖完全水解最關(guān)鍵的酶，其作用于木聚糖主鏈的木聚糖苷鍵，隨機(jī)切斷主鏈內(nèi)的糖苷鍵，水解木聚糖而生成分子量大小不同的寡糖[18]。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶能使組成細(xì)胞壁的不溶性木聚糖變成可溶性木聚糖，從而迅速降解細(xì)胞壁[19]。在病原菌侵染植物的過(guò)程中，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶參與了細(xì)胞壁的降解，表明它在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20]。然而，目前大麗輪枝菌中木聚糖酶研究仍較少，本研究從大麗輪枝菌基因組中鑒定β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)這些基因在棉花不同抗感品種根系分泌物中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在揭示β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因與大麗輪枝菌致病性的聯(lián)系，為進(jìn)一步研究β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在大麗輪枝菌致病過(guò)程中的作用以及揭示致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

大麗輪枝菌V991菌株由石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，2個(gè)陸地棉品種‘新陸早7號(hào)’(感黃萎病)和‘中植棉2號(hào)’(耐黃萎病)均由石河子大學(xué)棉花研究所提供。

1.1.1 棉花根系分泌物的收集 將‘新陸早7號(hào)’和‘中植棉2號(hào)’品種的種子浸泡在1%(1 g NaClO加入100 mL H2O)NaClO溶液中進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌蒸餾水反復(fù)沖洗后種在經(jīng)過(guò)高溫高壓(121 ℃，60 min)滅菌處理的沙土中。每個(gè)品種種植2盆，每盆9株苗，光周期為16 h/8 h，溫度28 ℃，每3 d用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次。 45 d后，從沙土中取出棉苗，用2 L滅菌水浸泡砂土，使根系分泌物充分溶解在水中，用細(xì)菌過(guò)濾器 (0.22 μm)過(guò)濾水溶液，在冷凍干燥機(jī)中濃縮至0.5 L。

1.1.2 大麗輪枝菌的培養(yǎng)與取樣 將貯存的大麗輪枝菌V991分生孢子培養(yǎng)于察氏培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d。收集新鮮的分生孢子，分別稱取0.5 g分生孢子接菌于5 mL不同抗感棉花品種的根系分泌物中。25 ℃ 220 r/min搖培0、6和12 h后，收集V991的分生孢子。根系分泌物培養(yǎng)前0 h的大麗輪枝菌樣本，標(biāo)記為CK；感病品種‘新陸早7號(hào)’根系分泌物培養(yǎng)6 h和12 h的樣本，分別標(biāo)記為VDX6和VDX12；耐病品種‘中植棉2號(hào)’根系分泌物培養(yǎng)6 h和12 h的樣本，分別標(biāo)記為VDZ6和VDZ12；同時(shí)用水培養(yǎng)大麗輪枝菌，培養(yǎng)6 h和12 h的樣本分別標(biāo)記為VDW6和VDW12。每處理2個(gè)重復(fù)用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共構(gòu)建14個(gè)文庫(kù)。

1.2 方 法

1.2.1 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的鑒定 從http://fungi.ensembl.org/Verticillium_dahliae/Info/Index/ 下載大麗輪枝菌全基因組編碼序列CDS(Coding sequence) GCF_000150675.1_ASM15067v2-rna序列文件、GCF_000150671_ASM15067v2-protein 蛋白質(zhì)序列文件、GCF_000150675.1_ASM15067v2_ genomic全基因組序列文件，以及Verticillium_dahliaeASM15067v2.42 GFF3文件。利用TBtools v 0.66443軟件對(duì)GFF3文件中所有β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因進(jìn)行搜索，同時(shí)在CDS、蛋白質(zhì)、全基因組序列文件中獲取基因?qū)?yīng)的cDNA序列、蛋白質(zhì)序列以及基因組序列。

1.2.2 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的氨基酸序列分析 利用ExPAsy(http://web.expasy.org)工具在線分析β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本理化性質(zhì)，包括氨基酸序列大小、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等。利用在線工具WOLFPSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)和 TMHMM(http://www.cBMs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對(duì)編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)[21]。

1.2.3 多重序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析 采用DNAMAN 6.0和ClustalX 2.0對(duì)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。利用SMART工具在線預(yù)測(cè)11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白序列的信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域，并用DOG 1.0軟件進(jìn)行繪制。以11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白序列的主結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结樞蛄校贑aZy數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.cazy.org/)查找其他物種中的相應(yīng)蛋白[22]，去除重復(fù)以及不完整序列后，挑選9條其他物種中的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白序列用于進(jìn)化樹分析。利用MEGA 6.0提供的ClustalW程序?qū)Υ篼愝喼捌渌锓N中的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后通過(guò)鄰位相連法構(gòu)建基因的復(fù)合進(jìn)化樹。

1.2.4 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的染色體分布 從大麗輪枝菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因染色體分布以及長(zhǎng)度信息，利用TBtools v0.66443軟件繪制β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的染色體分布圖。

1.2.5 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因結(jié)構(gòu)分析 從全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載該基因的外顯子和內(nèi)含子信息，利用在線軟件Gene Structure Display Server (GSDS)(http://gsds.cBMi.pku .edu.cn/)分析大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因外顯子-內(nèi)含子的數(shù)目及分布。

1.2.6 大麗輪枝菌樣本RNA的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 采用RNA simple total kit試劑盒(Tiagen，中國(guó)北京)提取大麗輪枝菌總RNA，利用Nanodrop○R2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，de，USA)和Agilent 2100生物分析儀(Agilent TeGHnologies，Santa Clara，CA，USA)分別檢測(cè)RNA的純度和完整性，利用Qubit○R2.0熒光計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington，de，USA)對(duì)RNA的濃度進(jìn)行精確測(cè)量，最終獲得高質(zhì)量的RNA樣本用于RNA測(cè)序。采用Illumina HiSeqTM4000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為PRJNA545805。

1.2.7 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因?qū)Σ煌藁垢衅贩N根系分泌物的響應(yīng)分析 對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的raw reads進(jìn)行質(zhì)量控制后，利用HISAT軟件將得到的clean reads比對(duì)到大麗輪枝菌的參考基因組數(shù)據(jù)(http//www.broadinstitute.org/annotation/genome/Verti- cillium dahlia /Blast.html)。采用HTSeq軟件對(duì)各樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平分析，使用的模型為union，分別統(tǒng)計(jì)單個(gè)基因的表達(dá)水平。FPKM(fragments per kilobase of exon per millon fragments mapped)為每百萬(wàn)fragments中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目，同時(shí)考慮測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)fragments計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法[22]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的FPKM值，并采用HemI軟件繪制基因在不同抗感棉花品種根系分泌物中的表達(dá)熱圖，使用Excel 2010制作基因表達(dá)折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的鑒定

通過(guò)TBtools軟件查找GFF3文件中所有 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因，共獲得11條關(guān)于β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的記錄，分別為VDAG_03385～VDAG_08273(表1)。這些基因編碼序列(coding sequence, CDS)長(zhǎng)度為666～1 314 bp，編碼221～437個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為23.90～47.64 ku，理論等電點(diǎn)為5.09～10.00。對(duì)各成員序列的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，這些基因大多(7個(gè))為細(xì)胞膜外蛋白，部分定位于細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞核中(表1)。其結(jié)果與角毛殼菌生物信息學(xué)分析一致，說(shuō)明該酶蛋白主要在胞外發(fā)揮水解木聚糖的生物學(xué)作用[23]。

2.2 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶的保守域分析

利用蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域在線分析工具TMHMM(http://www.cBMs.dtu.dk/services/)發(fā)現(xiàn)，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain, TM)。利用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batGH.pl)對(duì)11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)酶中 VDAG_03790、 VDAG_05042、 VDAG_05043、 VDAG_05294和 VDAG_06165均含有糖苷水解酶Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域，其中 VDAG_06165還含有一個(gè)fCBD(cellulse biding domain；真菌纖維素結(jié)合域)結(jié)構(gòu)域； VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744均含有糖苷水解酶Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域； VDAG_05509和 VDAG_03808均含有糖苷水解酶 Glyco_Hydro 43結(jié)構(gòu)域，其中 VDAG_03808還含有一個(gè)CBM(carbohydrate binding modules；碳水化合物結(jié)合域)結(jié)構(gòu)域(圖1)。VDAG_03385、 VDAG_08273、 VDAG_04744、 VDAG_06165V、DAG_03809和 VDAG_05509含有不同長(zhǎng)度的信號(hào)肽(圖1)。

將 VDAG_03790、 VDAG_05042、 VDAG_05043、 VDAG_05294和 VDAG_06165蛋白的Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GGKGW、YGW、EYY和STR區(qū)域具有較強(qiáng)的保守性(圖2-A)。將 VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744蛋白的Glyco_hydro10的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)，保守區(qū)域?yàn)閃DVVNE、ADP、NDY和TELD(圖2-B)。對(duì)VDAG_03808和VDAG_05509蛋白的Glyco_Hydro 43結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對(duì)，KGVRD和IATDL區(qū)域具有較強(qiáng)的保守性(圖2-C)。這些保守性區(qū)域可能與木聚糖酶的催化相關(guān)[24-25]。

表1 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的特征Table 1 Characterization of Endo-β-1,4-xylanase genes in V.dahliae

黑色表示信號(hào)肽；深藍(lán)色表示Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域；淺藍(lán)色表示Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域；粉色表示Glyco_Hydro 43結(jié)構(gòu)域；黃色表示fCBD結(jié)構(gòu)域；橙紅色表示CBM結(jié)構(gòu)域

The black indicates signal peptide;Dark blue indicates the Glyco_hydro10 domain; Light blue indicates the Glyco_hydro11 domain; Pink indicates the Glyco_Hydro 43 domain; Yellow indicates the fCBD domain;Orange red indicates the CBM domain

圖1 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白結(jié)構(gòu)域分析
Fig.1 Domains analysis of Endo-β-1,4-xylanase proteins inV.dahliae

A為VDAG_03790、VDAG_05042、VDAG_05043、VDAG_05294和VDAG_06165蛋白Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)；B為VDAG_08273、VDAG_03385、VDAG_03809和VDAG_04744蛋白Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)；C為VDAG_03808和VDAG_05509蛋白Glyco_Hydro 43結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)?；疑秃谏珔^(qū)域分別代表 75%以上和 100%的保守區(qū)。黑色方框表示氨基酸保守區(qū)域

A indicates a multiple sequence alignment of Glyco_hydro11 domain in VDAG_03790, VDAG_05042, VDAG_05043, VDAG_05294, and VDAG_06165 proteins; B indicates a multiple sequence alignment of Glyco_hydro10 domain in VDAG_08273, VDAG_03385, VDAG_03809 and VDAG_04744 proteins; C indicates a multiple sequence alignment of Glyco_Hydro 43 domain in VDAG_03808 and VDAG_05509 proteins.The gray and black areas represent more than 75% and 100% of conservative regions, respectively.Black boxes indicate regions of amino acid conservation

圖2 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)
Fig.2 Multiple sequence alignment of domains in Endo-β-1,4-xylanase proteins fromVerticilliumdahliae

2.3 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白的進(jìn)化關(guān)系分析

在CaZy數(shù)據(jù)庫(kù)中查找并隨機(jī)選取9個(gè)來(lái)自其他物種的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白記錄，其中XP_018153852.1(十字花科炭疽病菌)、EPS36346.1(捕食線蟲真菌)、ABR14629.1(宇佐美曲霉)和RGP60782.1(擬枝孢鐮刀菌)屬于糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)10家族成員，BAE71410.1(黑色素短梗霉)、ACS96449.1(嗜酸真菌)和ACR83565.1(黑曲霉)屬于11家族成員，XP_013423968.1(出芽短梗霉)和THY53895.1(出芽短梗霉)屬于43家族成員。利用MEGA 6.0軟件將上述9個(gè)蛋白與11個(gè)大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果如圖3所示，20個(gè)糖苷水解酶基因被清晰地分為3組。 VDAG_06165、 VDAG_03790、 VDAG_05294、VDAG_0 5042和 VDAG_05043與其他物種中11家族成員聚為一類； VDAG_08273、 VDAG_03385、 VDAG_03809和 VDAG_04744與其他物種中10家族成員聚為一類； VDAG_05509和 VDAG_03808與其他物種中43家族成員聚為一類。該結(jié)果與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，表明大麗輪枝菌11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白中，含有5個(gè)糖苷水解酶11家族成員，4個(gè)10家族成員和2個(gè)43家族成員。

2.4 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS對(duì)獲得的11個(gè)β-1, 4-內(nèi)切木聚糖基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示：VDAG_06165基因外顯子和內(nèi)含子最多，含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子；VDAG_05042和VDAG_08273基因外顯子和內(nèi)含子較少，分別含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。其余8個(gè)基因中，4個(gè)基因(VDAG_03385、VDAG_03809、VDAG_04744和VDAG_03808)含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)基因(VDAG_05294、VDAG_05043、VDAG_05042和VDAG_05509)含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。

10、11和43分別指糖苷水解酶10、11和43家族

10、11 and 43 refer to glycoside hydrolase families of 10、 11 and 43, respectively

圖3 大麗輪枝菌和其他物種中β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶蛋白進(jìn)化樹分析
Fig.3 Phylogenetic tree analysis of Endo-β-1,4-xylanase proteins inV.dahliaeand other species

藍(lán)色表示UTR(上下游序列),綠色表示編碼區(qū),灰線表示內(nèi)含子區(qū)

The blueindicates UTR, the green indicates the exon, and the gray indicates the intron

圖4 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因結(jié)構(gòu)分析
Fig.4 Gene structures analysis of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliae

2.5 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的染色體分布

大麗輪枝菌有8條染色體，Chr01長(zhǎng)度為 5 243 713 bp，Chr02為5 264 584 bp，Chr03為 5 534 790 bp，Chr04為3 754 323 bp，Chr05為 3 249 347 bp，Chr06為2 537 490 bp，Chr07為 3 147 721bp，Chr08為2 984 914 bp。11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因分布在其中5條染色體上(圖5)。3號(hào)染色體上分布的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因最多，包括VDAG_03790、VDAG_03808、VDAG_03809和VDAG_04744四個(gè)基因，它們的基因組序列長(zhǎng)度分別為893 bp、1 315 bp、956 bp和1 172 bp。8號(hào)染色體上分布的基因最少，僅含VDAG_06165基因，其基因組長(zhǎng)度為1 438 bp。2號(hào)、4號(hào)和6號(hào)染色體上分別分布2個(gè)基因，VDAG_05294與VDAG_05509分布于2號(hào)染色體上，它們的基因組序列大小分別為779 bp和1 118 bp；VDAG_05042和VDAG_05043分布于4號(hào)染色體上，它們的基因組序列大小分別為748 bp和806 bp；VDAG_03385和VDAG_08273分布于6號(hào)染色體上，它們的基因組序列大小分別為1 645 bp和1 091 bp。根據(jù)200 kb的核苷酸中含有3個(gè)以上基因即為1個(gè)基因簇[26]，3號(hào)染色體上的4個(gè)基因形成1個(gè)基因簇，其他染色體上未形成基因簇。

圖5 大麗輪枝菌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在染色體上的分布Fig.5 Chromosomal distribution of Endo-β-1,4-xylanase genes in V.dahliae

2.6 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因?qū)Σ煌垢忻藁ㄆ贩N根系分泌物的響應(yīng)分析

抗病品種根系分泌物對(duì)病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而感病品種根系分泌物則能刺激病菌生長(zhǎng)[27-28]。根據(jù)不同抗感棉花品種根系分泌物培養(yǎng)6 h和12 h的大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，獲得β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因培養(yǎng)后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FPKM值，用HemI軟件繪制基因在不同抗感棉花根系分泌物中的表達(dá)熱圖。根據(jù)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在不同抗感根系分泌物中表達(dá)模式的差異(圖6)，11個(gè)基因被劃分為3組，第3組基因(VDAG_03790、VDAG_03808、VDAG_03809、VDAG_05043和VDAG_06165)的表達(dá)量在感病品種根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌(VDX6和VDX12)中明顯較高，而在耐病品種根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌(VDZ6和VDZ12)和水培養(yǎng)的大麗輪枝菌(VDW6和VDW12)中表達(dá)量較低。結(jié)合5個(gè)基因的FPKM折線圖(圖7)可見(jiàn)，VDAG_03790在感病品種根系分泌物培養(yǎng)6 h的樣本中表達(dá)量明顯升高；VDAG_03808在感病品種根系分泌物培養(yǎng)6 h和12 h的樣本中表達(dá)量均較高，VDAG_03809、VDAG_05043和VDAG_06165在感病品種根系分泌物培養(yǎng)12 h的樣本中表達(dá)量明顯升高。而5個(gè)基因在耐病品種根系分泌物和水培養(yǎng)的樣本表達(dá)量未見(jiàn)明顯升高。上述分析表明5個(gè)基因均對(duì)感病品種根系分泌物產(chǎn)生響應(yīng)，暗示它們與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)。

紅色和藍(lán)色分別代表基因表達(dá)水平的高低

Red and blue bands represent high and low gene expression levels, respectively

圖6 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在不同抗感棉花
根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌中的表達(dá)熱圖
Fig.6 Heat map of Endo-β-1,4-xylanase genes
inV.dahliaecultured root exudates
from different resistant cottons

3 結(jié)論與討論

糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)亦稱糖苷酶，是作用于各種糖苷或寡糖使糖苷鍵水解的酶的總稱。CAZy(Carbohydrate-Active enzymes Database)數(shù)據(jù)庫(kù)以糖苷水解酶與唯一性底物特異性結(jié)合原理，將糖苷水解酶家族分為130個(gè)家族[29-30]。內(nèi)切木聚糖酶主要存在于兩個(gè)離散的序列家族第10和11家族[31]。本研究通過(guò)對(duì)大麗輪枝菌中11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)基因含有Glyco_hydro11結(jié)構(gòu)域，與其他物種中11家族成員聚為一類，屬于糖苷水解酶11家族；4個(gè)基因含有Glyco_hydro10結(jié)構(gòu)域，與其他物種中10家族成員聚為一類，屬于10家族；2個(gè)基因含有Glyco_hydro43結(jié)構(gòu)域，與其他物種中43家族成員聚為一類，屬于43家族。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析還發(fā)現(xiàn)VDAG_06165中含有一個(gè)fCBD結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為存在于大多數(shù)真菌纖維素酶和半纖維素酶中[32]。CBD結(jié)構(gòu)域在木聚糖酶降解天然植物細(xì)胞壁木聚糖中起著重要的作用[32-33]，它是由33～36個(gè)氨基酸組成的具有高度保守性的區(qū)域。由于VDAG_06165含有fCBD結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該基因可能與降解木聚糖有關(guān)。VDAG_03808中含有一個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是碳水化合物結(jié)合模塊(CBMS)，通常存在于較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列中，與碳水化合物活性酶的催化模塊(例如糖苷水解酶和多糖裂合酶)共存，在那里它們可增強(qiáng)酶模塊的催化活性[34]。CBM通過(guò)使酶接近纖維素表面來(lái)影響酶的活性[30,34]。

VDX表示β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在感病棉花品種根系分泌物中表達(dá)量；VDZ表示β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在抗病棉花品種根系分泌物中表達(dá)量；VDW表示β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在水培養(yǎng)中表達(dá)量

VDX represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with root exudates from susceptible cultivars;VDZ represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with root exudates from tolerance cultivars;VDW represents the expression level of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliaecultured with water

圖7 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在不同抗感棉花品種根系分泌物培養(yǎng)的
大麗輪枝菌中FPKM值的變化趨勢(shì)圖
Fig.7 Change trend of FPKM value of Endo-β-1,4-xylanase genes inV.dahliae
cultured with root exudates from different resistant cottons

糖苷水解酶43家族成員均含有Glyco_hydro43結(jié)構(gòu)域，催化果膠降解的果膠酶一般含有該結(jié)構(gòu)域[25]。本研究中VDAG_03808和VDAG_05509均含有糖苷水解酶43家族結(jié)構(gòu)域，推測(cè)這兩個(gè)基因可能參與果膠的降解。在所有含有糖苷水解酶43主結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，69%的蛋白質(zhì)還含有一個(gè)信號(hào)肽，將翻譯后的蛋白質(zhì)導(dǎo)向細(xì)胞質(zhì)外。VDAG_03808中無(wú)信號(hào)肽；VDAG_05509含有1～19 bp長(zhǎng)度分泌信號(hào)肽，推測(cè)該基因編碼的分泌蛋白在細(xì)胞外發(fā)揮作用。

根系分泌物是植物根系在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放到介質(zhì)中的全部有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)。大麗輪枝菌通過(guò)根系入侵棉花，因此根系分泌物的生物學(xué)效應(yīng)對(duì)大麗輪枝菌的成功侵染至關(guān)重要[28，35-36]。棉花根系分泌物富含氨基酸和糖類，抗病品種和感病品種的根系分泌物成分有明顯差異。與抗病棉花品種根系分泌物相比，感病品種根系分泌物中富含天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和脯氨酸等大量氨基酸，葡萄糖、果糖和蔗糖含量明顯較高[37]?？共∑贩N根系分泌物抑制大麗輪枝菌的生長(zhǎng)，而感病品種根系分泌物促進(jìn)其生長(zhǎng)[22,28]。目前棉花根系分泌物對(duì)基因表達(dá)的影響研究仍較少，VdRGS1在根系分泌物處理的大麗輪枝菌中的表達(dá)量明顯升高，基因敲除和回補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因與大麗輪枝菌孢子生產(chǎn)、菌絲發(fā)育、微菌核的形成和致病性相關(guān)[13]。本研究分析不同抗感棉花品種根系分泌物對(duì)11個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的表達(dá)的影響。

植物病原真菌可以產(chǎn)生一系列細(xì)胞壁降解酶，以促進(jìn)感染和定植，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等。近年來(lái)，研究人員已利用基因敲除手段對(duì)大麗輪枝菌中細(xì)胞壁降解相關(guān)基因的功能進(jìn)行研究，但由于這些基因都是以基因家族的形式存在，導(dǎo)致基因的功能研究未獲得確定性的結(jié)果。因此，確定基因家族中對(duì)致病性起關(guān)鍵作用的基因?qū)τ诖篼愝喼虏》肿訖C(jī)制的解析是十分必要的。本研究通過(guò)制作11個(gè)基因在不同抗感棉花根系分泌物中的表達(dá)熱圖和部分基因的表達(dá)折線圖，發(fā)現(xiàn)5個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因在感病品種根系分泌物培養(yǎng)的大麗輪枝菌中明顯上調(diào)，而在耐病品種根系分泌物和水培養(yǎng)的樣本中未明顯上調(diào)，表明它們對(duì)感病品種的根系分泌物有明顯的響應(yīng)，暗示它們可能與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)，這些基因可用作今后利用基因敲除技術(shù)研究基因功能與大麗輪枝菌致病分子機(jī)制的目標(biāo)基因。