陜西不同地區(qū)馬鈴薯腐爛莖線蟲的分離鑒定及同源性分析

劉 晨，楊藝煒，王家哲，常 青，洪 波，張 鋒

(陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043)

馬鈴薯俗稱土豆，作為全球第四大糧食作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[1]。但中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)一直飽受病害困擾，馬鈴薯病害嚴重制約國內(nèi)馬鈴薯單位面積產(chǎn)量的提升以及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展，目前陜西省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)面臨著同樣問題。甘薯已經(jīng)成為中國許多省(區(qū))調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要作物，甘薯在陜西省也逐步成為重要經(jīng)濟作物，對于帶動區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)也被稱為Potato nematode，最初發(fā)現(xiàn)于馬鈴薯上，是其貯藏期一種重要病害[2]，也是嚴重為害馬鈴薯的重要病原之一[3]。在中國，馬鈴薯腐爛莖線蟲首次在甘薯上被分離出來，發(fā)生嚴重時可造成80%以上的減產(chǎn)，甚至絕收[4-5]。此外，腐爛莖線蟲還可為害蠶豆、小麥、當歸、三七等幾十種農(nóng)作物及中藥材[6]。

馬鈴薯腐爛莖線蟲目前主要分為2類基因型，有文獻[7]報道這2個基因型在尾長、C值、V值等形態(tài)特征值上存在顯著差異。2007年，有學者[8]對多個馬鈴薯腐爛莖線蟲種群的核糖體ITS區(qū)序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在中國不同地理種群明顯分為2個生物型，即A型和B型這兩種。此外，還有多篇文獻也證實馬鈴薯腐爛莖線蟲種群中存在2類基因型這一結(jié)論[9-11]。有國外學者將不同寄主作物上的馬鈴薯腐爛莖線蟲群體分為A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型這7個不同生物型[12-13]。A型僅在中國發(fā)現(xiàn)，且只為害甘薯，B型和E型主要為害甘薯和馬鈴薯，C型寄主為馬鈴薯、甘薯及大蒜，D型可侵染大蒜，F(xiàn)型在甘薯和黃芪上有分離出來，G型為害馬鈴薯。

1925年，馬鈴薯腐爛莖線蟲首次在美國甘薯上被發(fā)現(xiàn)[14]，傳入中國后，在北京、山東、河北等甘薯生產(chǎn)區(qū)均造成嚴重為害[15]。馬鈴薯腐爛莖線蟲在國外主要為害馬鈴薯，在國內(nèi)主要為害甘薯，但近幾年，在甘肅等地也發(fā)現(xiàn)此線蟲為害馬鈴薯[16-18]。因此，明確該病原線蟲的生物型及系統(tǒng)發(fā)育地位，可為其致病性研究奠定基礎，同時為馬鈴薯及甘薯生產(chǎn)區(qū)腐爛莖線蟲的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年3月至12月期間，馬鈴薯腐爛莖線蟲采自陜西省榆林市定邊縣、靖邊縣、神木縣及榆陽區(qū)的馬鈴薯發(fā)病田，及陜西省渭南市合陽縣及興平市的甘薯發(fā)病田。

1.2 試驗方法

1.2.1 線蟲的分離 將不同地區(qū)采集病薯的典型病塊區(qū)切下，切成1 cm×1 cm小塊，清水沖洗干凈，取雙層面巾紙將其包住，采用漏斗分離線蟲。收集到的線蟲用0.5%次氯酸鈉浸泡、消毒5 min，無菌水沖洗3遍，保存，備用。

1.2.2 形態(tài)學鑒定、線蟲標本制作及特征值測量 將分離得到的腐爛莖線蟲懸浮液，置于65 ℃水浴處理0.5 min熱力殺死[19-21]，并制成玻片以供觀察。應用EZcam軟件，在顯微鏡下對腐爛莖線蟲的主要形態(tài)特征進行觀察、測量及拍照。主要測量數(shù)據(jù)包括線蟲的體長(L)、體寬(W)、口針長度(S)、頭長(H)、尾長(T)等[22]，對比不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲在形態(tài)上的差異。每組測量20條線蟲，計算平均值。

掃描電鏡觀察：將線蟲置于裝有5%戊二醛的離心管中于4 ℃下固定3 h，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液進行沖洗之后，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲，用超聲波清洗儀將線蟲于30 ℃條件下清洗30 min，經(jīng)體積分數(shù)依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級脫 8 min，離心2 min。再依次用乙酸異戊酯與無水乙醇體積比分別為1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的乙酸異戊酯與無水乙醇混合液置換，每步置換6 min，離心2 min，EMITECH-K850型臨界點干燥儀干燥，MSP-1S型離子濺射儀噴金鍍膜，在HITACHI-3400N型掃描電子顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 分子生物學鑒定提取線蟲DNA 向1.5 mL離心管內(nèi)加入16 μL×PCR Buffer(去Mg2+)、4 μL蛋白酶K、40 μL ddH2O，再將線蟲放入混合液中；將離心管置于液氮中研磨，反復研磨3次；離心管水浴65 ℃保溫90 min；再放置 85 ℃金屬浴10 min，取出放至室溫即可用于PCR擴增。

PCR擴增條件：反應選取腐爛莖線蟲線粒體COI通用引物、核糖體ITS通用引物及A型生物型及B型生物型的特異性引物(表1)。

表1 用于鑒定馬鈴薯腐爛莖線蟲的引物Table 1 Primers of Ditylenchus destructor

PCR反應體系為2×TaqMix 25 μL(上海生工)，20 μmol/L上游引物2 μL，20 μmol/L下游引物2 μL，DNA模板2 μL，H2O補充總體積至50 μL。PCR 擴增反應為95 ℃預變性4 min， 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35個循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。PCR反應結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司，進行測序(Sanger 測序)。利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)分別對線粒體COⅠ及核糖體ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛莖線蟲形態(tài)學鑒定

在40倍顯微鏡下觀察可見，雌性腐爛莖線蟲溫熱死亡后蟲體略向腹部彎曲，蟲體表角質(zhì)膜上有細環(huán)紋，環(huán)距1 μm ，唇區(qū)低且平滑，稍突出于體外，頭區(qū)與體軀之間有一輕微的溢縮。蟲體側(cè)寬約占整體寬的1/5 ，側(cè)線6 條(圖1)。食道屬墊刃型，口針細小，長10～13 μm ，口針基球小而明顯，呈圓形(圖2)。中食道球卵圓形，肌肉質(zhì)，具瓣門。狹部窄，其上環(huán)繞神經(jīng)環(huán)。后食道腺體從背面或側(cè)面交蓋腸的前端，約交蓋半個體寬至1 個體寬。后陰子宮囊明顯，其長度一般為陰門到肛門距離的2/3。卵母細胞在近子宮處單行排列。后陰子宮囊長約達陰門至肛門距離的3/4 位置處。尾圓錐形，略向腹部彎，尾端細圓(圖2)。

雄蟲蟲體前端形態(tài)與雌性蟲形態(tài)相似，尾略窄，尾端細圓；交合刺略向腹部彎曲。交合傘始于交合刺前端相對應的位置，向后伸約尾長的75%，基部膨大, 其寬處有2個指狀突起；引帶簡單且短(圖2)。

2.2 不同生物型腐爛莖線蟲特征值測量

對不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲雌、雄成蟲各測量20頭，測量結(jié)果見表2。

A.6面輻射狀唇片；B.交合傘始于交合刺前端；C.體中側(cè)區(qū)6條側(cè)線

A.Six radial labrum; B.Copulatory bursa begins at the front of speculum; C.Six lateral lines of middle body side

圖1 馬鈴薯莖線蟲掃描電鏡照片
Fig.1 Stereoscan photograph ofDitylenchusdestructor

A.雄蟲交合刺側(cè)面及交合傘；B.交合刺腹面及指狀；C.雌蟲陰門及尾部；D.頭部溢縮及口針；標尺：A/B/C=25 μm，D=10 μm

A.Spiculum lateral surface and copulatory bursa of male; B.Segmental venter and finger of speculum; C.Cunnus and tail of female; D.Excessive shrinkage and lancet of head; scaleplate:A/B/C=25μm，D=10μm

圖2 馬鈴薯腐爛莖線蟲顯微鏡下特征形態(tài)Fig.2 Characteristic morphology under microscope of Ditylenchus destructor

注：a=體長/體寬；b=體長/體前部至腸前端距離；c=體長/尾長；V=體前端至陰門距離×100/體長。

Note:a=Length/width;b=Length/distance from anterior body to anterior intestine;c=Length/Tail;V=Distance from anterior end of body to vulva×100/length.

從表2可以看出，無論B型還是A型腐爛莖線蟲的雌成蟲均比雄成蟲體長長，體寬也略寬，合陽與興平的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲雌成蟲與雄成蟲在體長、a值、b值、c值及V值之間差異不顯著，B型腐爛莖線蟲雌成蟲與雄成蟲的體長均比A型的顯著減小，雌成蟲的V值B型比A型小，但a值B型高于A型，b值、c值差異不顯著。測量結(jié)果與郭全新等[19]、劉維志等[20]的測量結(jié)果基本一致。

2.3 腐爛莖線蟲分子鑒定

2.3.1 不同地區(qū)莖線蟲線粒體COI及核糖體ITS通用引物檢測結(jié)果 通過馬鈴薯腐爛莖線蟲的線粒體通用引物擴增陜北及關(guān)中合陽、興平的線蟲群體，從凝膠成像結(jié)果來看，所有樣品都擴增出480 bp條帶(圖3)。用馬鈴薯腐爛莖線蟲ITS通用引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示，為害陜北馬鈴薯的莖線蟲均有約950 bp的條帶，關(guān)中合陽、興平甘薯上莖線蟲均擴增出約760 bp的條帶(圖4)。因此可以確定所有這些線蟲樣品均為馬鈴薯腐爛莖線蟲。

2.3.2 不同地區(qū)腐爛莖線蟲生物型鑒定結(jié)果 為確定不同地區(qū)馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型是否相同，選取A型與B型的特異性引物擴增陜北、合陽及興平的馬鈴薯種群。從圖5可以看出，榆林地區(qū)靖邊縣、定邊縣、神木縣及榆陽區(qū)為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲，合陽縣及興平市采集的為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲。

圖3 ITS區(qū)通用引物擴增結(jié)果Fig.3 Universal primer amplification of rDNA-ITS

2.4 rDNA-ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對馬鈴薯腐爛莖線蟲核糖體ITS通用引物擴增產(chǎn)物測序結(jié)果在NCBI上BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，陜北B型種群與登錄號為JZ133363、JZ133338的B型馬鈴薯腐爛莖線蟲群體同源性高達99.5%，關(guān)中A型種群與A型的MH992393的同源性高達99.1%。

使用腐爛莖線蟲核糖體ITS通用引物對陜北不同地區(qū)、合陽及興平的種群進行擴增及測序，利用MEGA6.0軟件，將這7個序列及NCBI上已知的5個序列號為JZ133363、JZ133338的B型及MH992393的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲種群分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從結(jié)果來看，種群DingB、JingB、ShenM及YuY的rDNA-ITS序列與已知序列MK979365、JZ133411聚為一支。XingP、HeY和 HeY2聚在一支。合陽的兩個不同樣品遺傳距離最近，與興平種群親緣性高，這3個種群均為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲，陜北的定邊縣及靖邊縣的種群遺傳距離最近，與神木縣及榆陽區(qū)的莖線蟲種群親緣性較高，這4個種群均為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲。同時，此系統(tǒng)發(fā)育樹成功將A型、B型兩個種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲成功區(qū)分開。此結(jié)果與分子鑒定結(jié)果較為一致。

圖4 線粒體通用引物擴增結(jié)果Fig.4 Universal primer amplification of mtDNA

圖5 A型、B型特異性引物擴增結(jié)果Fig.5 Specific primer amplification of type A and B

圖6 馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Ditylenchus destructorrDNA-ITS

3 結(jié)論與討論

通過對中國馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS序列對比可以看出，其種群主要分為A型和B型2個基因生物型[8,23]，但關(guān)于這2個生物型群體在形態(tài)特征、寄主范圍、病理學上等方面差異的研究較少[18]。本研究首次在陜西省發(fā)現(xiàn)該線蟲為害馬鈴薯及甘薯，并首次對陜西不同地區(qū)、不同寄主上該線蟲的生物型進行了形態(tài)學與分子生物學鑒定。結(jié)果顯示，侵染陜西省榆林馬鈴薯的為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲，侵染陜西省合陽及興平甘薯的為A型。形態(tài)特征值的測量結(jié)果顯示，A型馬鈴薯腐爛莖線蟲比B型的體長長，體寬略寬，雌成蟲的V值較大，但a值B型馬鈴薯腐爛莖線蟲高于A型，b值、c值差異不顯著。不同地區(qū)相同生物型的莖線蟲，在形態(tài)特征值上差異并不顯著。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，成功將A型、B型2個種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲區(qū)分開。

有研究[18,23-24]表明：中國山東、河北及江蘇等地甘薯上馬鈴薯腐爛莖線蟲可分為A型、B型2個生物型；有學者[12]在此基礎上將馬鈴薯腐爛莖線蟲種群分為A-G型7個單元型，A-F單元型均在中國有發(fā)生，而G型并未發(fā)現(xiàn)。關(guān)于陜西省是否還存在馬鈴薯腐爛莖線蟲的其他生物型，及不同生物型發(fā)生區(qū)域、侵染作物種類、生物特性及其他分子生物學方面是否存在差異，還需進一步調(diào)查研究，這將對有效預防及控制馬鈴薯腐爛莖線蟲的擴散提供理論依據(jù)。