SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和mic ro RNA表達(dá)的影響

張惠娟，黃大元，張 潔，唐海歐，謝安心，譚敦勇*

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 吉首 416000)

乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。近年來我國乳腺癌發(fā)病率不斷上升，成為我國女性惡性腫瘤的首位并呈現(xiàn)年輕化趨勢。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展被認(rèn)為是多種因素綜合作用的結(jié)果，眾多研究發(fā)現(xiàn)microRNA可通過調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮著類似于原癌基因或抑癌基因的作用，廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)是一類跨膜受體，催乳素(prolactin PRL)與PRLR結(jié)合后可活化下游的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮PRL的生殖調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖與分化調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[1]。有關(guān)PRLR研究表明，PRLR異常在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中具有潛在的重要作用[1-2]。丟失S2的催乳素短受體1a(delta S2 short form 1a PRLR，ΔS2 SF1a)為Tan等[2]學(xué)者于人類乳腺癌細(xì)胞及前列腺癌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)、克隆并報(bào)道的一類丟失S2的催乳素受體變體中的一種，是由催乳素短受體1a(short form 1a PRLR，SF1a)基因表達(dá)后經(jīng)hnRNA選擇性剪接而來，致使受體膜外區(qū)S1、S2兩個亞結(jié)構(gòu)域中的S2缺失，跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)與正常的SF1a-PRLR相同。這一結(jié)構(gòu)的缺失改變了PRLR的分子特性，可能引起下游細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)microRNA表達(dá)譜的改變，從而影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。基于此，本研究通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來初步探討SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR對乳腺癌細(xì)胞的影響；通過高通量測序研究它們對乳腺癌細(xì)胞內(nèi)microRNA表達(dá)的影響，對差異microRNA進(jìn)行分析，篩選出有意義的microRNA。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫惠贈；經(jīng)慢病毒包裝好的pLVX-con、pLVX-SF1a和pLVX-ΔS2 SF1a重組質(zhì)粒由我院醫(yī)學(xué)研究中心譚教授制備并保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM/F-12購于Gibco公司；嘌呤霉素購于深圳百恩維生物科技有限公司；MTS試劑盒購于Promega公司；Trizol購于Life-Technologies公司；小分子RNA Sample Prep Kit文庫構(gòu)建試劑盒購于Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組慢病毒、慢病毒包裝 利用同源重組技術(shù)將pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、SF1a-PRLR cDNA、ΔS2 SF1a-PRLR cDNA重組至慢病毒得到重組質(zhì)粒pLVX-con(不攜帶任何外源基因的空病毒)、pLVXSF1a和pLVX-ΔS2 SF1a，并經(jīng)過慢病毒包裝得到有活性的病毒顆粒，測定滴度后用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建、篩選、鑒定 上述包裝好的重組病毒分別轉(zhuǎn)染MCF-7得到對照組細(xì)胞(攜帶空病毒的MCF-7)、SF1a過表達(dá)組細(xì)胞(攜帶SF1a-PRLR cDNA慢病毒的MCF-7，SF1a)和ΔS2 SF1a過表達(dá)組細(xì)胞(攜帶ΔS2 SF1a-PRLR cDNA慢病毒的MCF-7，ΔS2 SF1a)。前后兩次用含5和2μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，收集部分過表達(dá)組細(xì)胞提取細(xì)胞基因組DNA做PCR鑒定(pLVX-SF1a、pLVX-ΔS2 SF1a鑒定所用引物：F，5′-CGCAAATG GGCGGTAGGCGTG-3′；R，5′-CGCGGATCCCTACT GGACTGTGGTCAATGTTGCC-3′)。

1.3.3 細(xì)胞增殖測定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的3組細(xì)胞均按每孔(1～2)×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每組6個復(fù)孔，用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，第2天更換為含1%FCS的DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞饑餓24 h后更換為含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再按照MTS Promega說明書測定細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值。實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.3.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA的提取與質(zhì)檢 將3組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞按每孔(4～6)×105個細(xì)胞接種于6孔板中用含10%FCS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時，加入PRL(5 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后使用Trizol法提取樣本總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定RNA的濃度與純度，用RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA完整性，檢測后挑選符合要求(RNA條帶清晰、28 S亮度大于18 S，D(260)/D(280)≥1.8，D(260)/D(230)≥1.5，濃度≥250 ng/μL)的RNA樣品送往上海美吉生物公司進(jìn)行測序?qū)嶒?yàn)。

1.3.5 小分子RNA測序及信息分析 送入公司的RNA經(jīng)Agilent 2100生物分析儀再次質(zhì)檢后進(jìn)行文庫構(gòu)建、文庫回收、TBS380微量熒光計(jì)定量、橋式PCR擴(kuò)增、Hiseq測序平臺進(jìn)行SE50測序。測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后采用Mirdeep 2軟件將所得小分子RNA(small RNA，sRNA)序列與參考基因組進(jìn)行比對分析，再將匹配序列分別與GenBank、Rfam、miRBase數(shù)據(jù)庫對比，篩選出microRNA序列并分類注釋，分析其表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料用表示，組間比較采用方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

1.4.2 microRNA的差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析 microRNA表達(dá)量采用TPM(transcripts per million)校準(zhǔn)，計(jì)算公式為：microRNA的歸一化表達(dá)量=(序列數(shù)×106)/總序列數(shù)。通過DEGseq軟件對已知microRNA表達(dá)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)公式“差異倍數(shù)=log2(兩樣本microRNA的TPM比值)”計(jì)算不同樣本之間的差異倍數(shù)。將|差異倍數(shù)|≥1且P＜0.05作為microRNA表達(dá)差異達(dá)到顯著水平的篩選條件。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)CR鑒定結(jié)果

瓊脂糖電泳過表達(dá)組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果如圖1所示，SF1a組在1 000與2 000 bp之間可見特異性條帶，ΔS2 SF1a組在750和1 000 bp之間可見特異性條帶，兩者產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符(SF1a cDNA長度為1 144 bp、ΔS2 SF1a cDNA長度為841 bp)，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞構(gòu)建成功。

A：SF1a PCR鑒定結(jié)果；B：ΔS2 SF1a PCR鑒定結(jié)果.M：marker；1：SF1a；2：ΔS2 SF1a.圖1 過表達(dá)組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株目的基因PCR產(chǎn)物鑒定

2.2 SF1a-PRLR、ΔS2 SF1a-PRLR對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

MTS法檢測細(xì)胞增殖情況的結(jié)果見圖2，對照組、SF1a組、ΔS2 SF1a組培養(yǎng)48 h時的培養(yǎng)液吸光度D(492)值分別為1.85±0.29、2.24±0.26、2.57±0.23。3組之間總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.248，P=0.001)；各組之間兩兩相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示過表達(dá)SF1a-PRLR、ΔS2SF1a-PRLR均能促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，且ΔS2 SF1a-PRLR促增殖作用更明顯。

2.3 RNA質(zhì)量檢測

RNA電泳結(jié)果見圖3，各組的28 S與18 S主片段明顯，無拖帶現(xiàn)象，前者亮度約是后者的2倍，表明RNA未發(fā)生降解；NanoDrop 2000和Agilent 2100檢測RNA純度D(260)/D(280)值1.94～2.02，D(260)/D(230)值為1.55～1.64，RNA完 整 性 指 數(shù)(RNA integration number，RIN)均為10(RIN≥8為完整性合格)，滿足測序要求(表1)。

組間比較采用方差分析LSD檢驗(yàn)方法，*P＜0.05.圖2 過表達(dá)SF1a和ΔS2 SF1a對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

2.4 各樣本序列分析及組成分布

1：對照組RNA；2：SF1a組RNA；3：ΔS2 SF1a組RNA.圖3 RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

表1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

測序原始序列經(jīng)質(zhì)量控制處理后，對照組、SF1a組和ΔS2 SF1a組分別獲得16 555 647、14 040 683、13 699 542個sRNA干凈序列(clean reads)，所獲序列長度主要集中于18～24 nt，見圖4，說明測序獲得的序列質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

圖4 sRNA序列長度分布統(tǒng)計(jì)

2.5 microRNA差異表達(dá)的分析

通過對clean reads比對分析，對照組、SF1a組和ΔS2 SF1a組細(xì)胞分別獲得991、894、827個microRNA成熟體序列，3組共同表達(dá)的microRNA成熟體序列有666個。

將microRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為TPM值后運(yùn)用DEGseq軟件分析3組microRNA的表達(dá)差異，結(jié)果為：SF1a組與對照組比較，差異表達(dá)的microRNAs共176個(32個上調(diào)，144個下調(diào))，上調(diào)幅度最大為9.36倍，下調(diào)幅度最大為8.73倍，差異倍數(shù)位于前10的microRNA表達(dá)分析見表2；ΔS2 SF1a組與對照組比較，差異表達(dá)的microRNAs共206個(52個上調(diào)，154個下調(diào))，上調(diào)幅度最大為9.63倍，下調(diào)幅度最大為10.09倍，差異倍數(shù)位于前10的microRNAs表達(dá)情況及功能見表3；從表4可見，ΔS2 SF1a組與SF1a組比較，差異表達(dá)的microRNAs共5個(4個上調(diào)，1個下調(diào))，上調(diào)幅度最大為2.33倍，其中miR-210-5p在對照組、SF1a組、ΔS2 SF1a組細(xì)胞中的相對表達(dá)水平分別為66.18、31.67、13.07，miR-210-5p在3組樣品中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過比對表2和表3中的差異microRNA(已將共有差異microRNA加粗)，發(fā)現(xiàn)SF1a組、ΔS2SF1a組與對照組相比共有的差異表達(dá)microRNA中，上調(diào)幅度位于前10的microRNA中存在8個共有的差異表達(dá)microRNAs，下調(diào)幅度位于前10的microRNA中存在9個共有的差異表達(dá)microRNAs。

3 討論

本研究表明過表達(dá)SF1a-PRLR或ΔS2 SF1a-PRLR均能促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外增殖，均能顯著影響人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的microRNA表達(dá)，兩者對大部分microRNA表達(dá)的影響作用相似，僅對miR-4454、miR-215-5p、miR-7977、miR-622、miR-210-5p等5個microRNAs的影響具有顯著性差異。

miR-210-5p在3組樣品中的表達(dá)兩兩相比均具有顯著性差異，已有的研究表明miR-210過表達(dá)可引起腫瘤細(xì)胞G1/S期和/或G2/M期阻滯，干擾有絲分裂進(jìn)程，抑制腫瘤生長[21]。本研究中，miR-210-5p在對照組、SF1a組、ΔS2 SF1a組細(xì)胞中的相對表達(dá)水平分別是66.18、31.67、13.07，呈遞減狀態(tài)，因此我們認(rèn)為ΔS2 SF1a-PRLR和SF1a-PRLR能促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖可能與miR-210的表達(dá)量下調(diào)有關(guān)。但另有研究表明，miR-210在多種實(shí)體腫瘤中均有表達(dá)，在胰腺癌、乳腺癌等中表達(dá)上調(diào)[22-23]，而在卵巢癌、食管鱗癌中則呈現(xiàn)低表達(dá)，且在分化差的食管鱗癌腫瘤細(xì)胞中明顯偏低[24-25]。這種現(xiàn)象還難以解釋，提示miR-210作用的復(fù)雜性。相信隨著microRNA靶基因檢測技術(shù)的改進(jìn)，我們對miR-210生物作用的認(rèn)識會進(jìn)一步明晰。

表2 與對照組比較SF1a組細(xì)胞前10個表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的microRNA

表3 與對照組比較ΔS2 SF1a組細(xì)胞前10個表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的microRNA

通過文獻(xiàn)查閱了解到表2～表4中差異顯著的microRNA在腫瘤中的作用，其中，發(fā)揮促癌作用的microRNA僅有miR-1269b[4]和miR-181a-3p[17]、發(fā)揮抑癌作用 的 有miR-148a[3]、miR-577[5]、miR-190a-5p[6]、miR-488-3p[7]、miR-138-5p[8]、miR-455-3p[9]、miR-551b-3p[10]、miR-105-5p[11]、miR-1247-5p[12]、miR-338-3p[13]、miR-651-5p[14]、miR-449a[15]、miR-874-5p[16]、miR-622[20]，對癌細(xì)胞的作用尚無定論或未知的microRNA有miR-215-5p[18-19]、miR-210-5p[21-25]、miR-4739、miR-767-5p、miR-1298-5p、miR-1266-5p、miR-1283、miR-7977?？梢娺^表達(dá)SF1a-PRLR和ΔS2 SF1a-PRLR主要是影響抑癌類microRNA的表達(dá)。我們推測SF1a-PRLR和ΔS2SF1a-PRLR主要通過影響抑癌類microRNA的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。

總之，ΔS2 SF1a-PRLR作為變異的SF1a-PRLR，產(chǎn)生了更明顯的促進(jìn)培養(yǎng)狀態(tài)下的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外增殖作用，引起了乳腺癌細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的變化，這種促增殖作用的差異是否與本次測序研究篩選到的microRNA有關(guān)還需進(jìn)一步深入驗(yàn)證和研究，通過實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qPCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證測序結(jié)果的正確性，通過構(gòu)建差異microRNA的過表達(dá)載體和抑制表達(dá)載體來深入研究差異microRNA的生物學(xué)作用及分子調(diào)控機(jī)制，以進(jìn)一步探討ΔS2 SF1a-PRLR在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中潛在的作用及分子機(jī)制。

表4 ΔS2 SF1a與SF1a比較差異表達(dá)的microRNA