新疆哈薩克族食管鱗癌與長鏈非編碼RNA表達(dá)的關(guān)系

古麗扎熱葉·艾庫拉，譚 遙，帕力達(dá)·阿皮孜阿吉，*

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺放療科，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸腹放療科，新疆 烏魯木齊 830011)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)為超過200個核苷酸的非編碼RNA類型，具有很少或沒有蛋白質(zhì)編碼能力，在過去幾年中，已證明lncRNA參與許多生理和病理過程[1-2]并發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。食管癌的發(fā)病分布具有明顯地區(qū)差異，新疆哈薩克族食管癌發(fā)生率明顯高于同區(qū)生活的其他民族[3]。目前食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)確切的發(fā)病機(jī)制很大程度上仍然是未知的，有研究[2]表明有些lncRNA參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，但關(guān)于lncRNA在食管鱗癌中的差異表達(dá)研究較少，尤其在哈薩克族食管鱗癌中研究空白。本研究選取食管癌高發(fā)病區(qū)新疆哈薩克族食管鱗癌作為研究對象，利用lncRNA表達(dá)譜芯片對食管鱗癌組織及癌旁組織中對lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，以篩選差異表達(dá)的lncRNA并分析其在ESCC發(fā)生發(fā)展中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 樣本收集 收集2010年3月—2013年3月期間在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性手術(shù)的4例哈薩克族食管癌患者的新鮮組織標(biāo)本，年齡50～70歲，平均年齡60歲，臨床分期：4例患者病理分期均為Ⅱ期，病理均為鱗狀細(xì)胞癌。研究4對新鮮食管癌組織及對應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm)標(biāo)本并切取適量置于事先預(yù)冷的1.5 mL無RNA酶(RNase-free)EP管內(nèi)，食管組織樣本于-80℃低溫冰箱中長期保存。本實驗樣本由新疆腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.1.2 試劑及儀器 NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒、Nucleospin?ExtractⅡ試劑盒均購自美國MACHEREY-NAGEL公司；晶芯?生物芯片通用標(biāo)記試劑盒購自北京CapitalBio公司；紫外分光光度計ND-1000購自美國NanoDrop公司；Agilent芯片掃描儀G2565CA購自美國Agilent公司。

1.1.3 芯片 由烏魯木齊英捷領(lǐng)先生物技術(shù)有限公司定制的Agilent lncRNA芯片V4.0，包含34 235個mRNA檢測探針和40 916個lncRNA檢測探針。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和處理 取一份鋁箔紙包埋的冰凍組織標(biāo)本(50～100 mg)，在液氮冷凍狀態(tài)下磨碎，加入Trizol試劑采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法提取組織總RNA，參照試劑使用說明書或?qū)嶒炇腋倪M(jìn)方法。經(jīng)DNA酶處理后，測定總RNA濃度，以瓊脂糖凝膠電泳、溴乙錠(替代品)顯色和紫外成像質(zhì)檢(18和28 S RNA)。嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，并對cDNA進(jìn)行純化。

1.2.2 芯片雜交 純化后的cDNA體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA，對產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，使用Agilent雜交盒，與lncRNA芯片進(jìn)行雜交，采用Agilent芯片掃描儀對清洗后的芯片進(jìn)行掃描，再使用配套軟件提取lncRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，Agilent GeneSpring軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和差異分析，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為：差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)在2.0倍以上，并且P＜0.05，從而篩選出癌組織和癌旁組織之間差異表達(dá)的lncRNA，同時對篩選出的差異表達(dá)基因做層次聚類分析。

1.2.3 食管癌相關(guān)的lnc RNA功能分析 結(jié)合lncRNA及其臨近靶基因mRNA的表達(dá)特征，構(gòu)建lncRNAmRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫找出靶基因相關(guān)的GO類別和信號通路。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，癌組和癌旁組lncRNA指標(biāo)之間采用配對t檢驗，GO和通路分析采用超幾何分布檢驗，差異倍數(shù)通過BH方法矯正，差異倍數(shù)越大，說明兩個樣品之間的差異越大，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 散點圖

火山圖是可以直觀反映差異基因的數(shù)量、顯著性和可靠性。簡單來說，圖中各點越靠近左上角和右上角，則其差異越顯著，篩選閾值默認(rèn)設(shè)置為P＜0.05。根據(jù)芯片數(shù)據(jù)結(jié)果分析得到的差異倍數(shù)與P值共同繪制的火山圖見圖1。食管鱗癌及其癌旁對照組織lncRNA差異表達(dá)聚類分析結(jié)果見圖2。

2.2 差異表達(dá)lnc RNA的篩選

選出食管鱗癌與其癌旁組織中差異表達(dá)的lncRNA，癌組織和癌旁組織之間差異表達(dá)lncRNA共有318個，與癌旁組織相比，癌組織中，125個lncRNA表達(dá)下調(diào)；其中下調(diào)95%以上的lncRNA為17個(見表1)；193個lncRNA表達(dá)上調(diào)，其中上調(diào)10倍以上的lncRNA為27個(見表2)。

2.3 差異表達(dá)lnc RNA功能預(yù)測

通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的lncRNA有10個靶基因，利用KEGG和GO數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行富集分析和通路分析。富集分析結(jié)果(表3)顯示，8個靶基因有5個GO類別，包括細(xì)胞外區(qū)、內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)代謝途徑、細(xì)胞外等，對靶基因的調(diào)控方式均為反式-調(diào)控方式。通路分析結(jié)果(表4)顯示靶基因參與2條信號通路途徑，包括軸突導(dǎo)向信號通路途徑和ECM受體相互作用信號通路途徑。

標(biāo)注為紅色的是上調(diào)基因，標(biāo)注為綠色的是下調(diào)基因，標(biāo)注為藍(lán)色的是無顯著差異基因.圖1 食管鱗癌及其癌旁對照組織差異表達(dá)lncRNA火山圖

每一列代表一個樣本，每一行代表一個基因在不同樣本中的表達(dá)程度，紅色表示相對高表達(dá)，藍(lán)色表示相對低表達(dá).圖2 食管鱗癌及其癌旁對照組織差異表達(dá)lncRNA聚類圖

3 討論

長鏈非編碼RNA已成為許多癌癥中關(guān)鍵的生物標(biāo)志物和調(diào)節(jié)因子，因其在多種生物過程中的重要作用而受到廣泛的關(guān)注，目前，眾多研究結(jié)果已證實lncRNA可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、表觀遺傳學(xué)、與DNA、RNA、蛋白質(zhì)分子相互結(jié)合，在多個重要節(jié)點調(diào)控腫瘤的進(jìn)展。lncRNA異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移信息相關(guān)。已研究顯示，多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌的發(fā)生和發(fā)展中l(wèi)ncRNA發(fā)揮著重要的作用[4-7]。劉長等[8]對結(jié)腸癌組織中篩選出928條差異表達(dá)的lncRNA，表明lncRNA與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。在ESCC中，YAO等[9]發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了癌癥的免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程。李夏君等[10]研究發(fā)現(xiàn)江蘇淮安食管鱗癌及癌旁組織篩選出表達(dá)差異的lncRNA共1 019個，其中399個上調(diào)，620個下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)這些lncRNA可能調(diào)控的mRNA主要參與了細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、蛋白酶活動等過程。李光華等[11]對新疆漢族食管癌組織中篩選出差異表達(dá)的lncRNA 680個，其中161個lncRNA表達(dá)上調(diào)，519個lncRNA表達(dá)下調(diào)。與李夏君等研究結(jié)果基本相似，因此本研究以新疆哈薩克族食管癌作為研究對象，通過基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)的lncRNA共318個，其中193個lncRNA表達(dá)上調(diào)，125個lncRNA表達(dá)下調(diào)，利用lncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)對差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，有10個靶基因，所有l(wèi)ncRNA均通過反式調(diào)控方式對靶基因進(jìn)行調(diào)控，GO和通路分析表明這些差異表達(dá)基因參與2條可能與食管鱗癌相關(guān)的信號通路，包括軸突導(dǎo)向信號通路和ECM受體相互作用信號通路途徑。富集分析發(fā)現(xiàn)共有5個GO類別，其中細(xì)胞成分有3個，生物過程有1個，分子功能有1個。已研究結(jié)果報道，在食管鱗癌中發(fā)現(xiàn)TNXB和ABLIM1基因表達(dá)下調(diào)，對食管鱗癌具有抑癌作用，與食管鱗癌的發(fā)生及發(fā)展密切相 關(guān)[12-13]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種基因分別參與軸突導(dǎo)向信號通路和ECM受體相互作用信號通路途徑，但其在食管鱗癌中表達(dá)水平需要進(jìn)一步驗證。

表1 與癌旁組織相比食管鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)95%以上的lncRNA

表2 與癌旁組織相比食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)10倍以上的lncRNA

表3 食管鱗癌差異表達(dá)lnc RNA靶基因預(yù)測及富集分析

表4 食管鱗癌差異表達(dá)lncRNA靶基因KEGG通路分析

目前許多研究表明lncRNA的已知功能不是簡單的信息傳遞分子，它們是具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制的分子，其延伸范圍很廣遠(yuǎn)超出我們的預(yù)測。盡管lncRNA不能編碼蛋白質(zhì)，但它們可以向下游傳遞信息并調(diào)控基因表達(dá)，所以在診斷和治療上，他們作為信息傳導(dǎo)分子可能比蛋白質(zhì)更有敏感性和特異性。

本研究結(jié)果初步從新疆哈薩克族食管鱗癌組織中篩選出差異表達(dá)的lncRNA指標(biāo)，但與既往研究結(jié)果相比，差異表達(dá)的lncRNA數(shù)量及靶基因差異較大，靶基因參與的信號通路也不盡相同，說明其差異表達(dá)基因群存在地區(qū)或人群差異，提示基于不同區(qū)域或不同族群遺傳背景的篩查分析的重要意義。目前本研究只篩選出與新疆哈薩克族食管鱗癌相關(guān)的lncRNA指標(biāo)，但其在食管鱗癌中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能以及食管鱗癌中的診斷價值需要進(jìn)一步探討。