中藥地錦草乙醇提取物體外抑制胃癌細胞增殖活性及機制研究

王耀杰，相曉晗，韓麗娜，李 軍，霍炳杰，趙連梅，*

(1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北石家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011；3．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊 050011)

地錦草(Euphorbia humifusa)，是屬于大戟科大戟屬地錦草種的一種廣泛分布于中國各地區(qū)的雙子葉植物。地錦草是中國藥典中記載的一種重要藥材，可用于治療痢疾、腸炎、黃疸和創(chuàng)傷性出血[1-2]。在既往的植物化學(xué)研究中，研究者從地錦草中分離出多種生物活性化合物，包括甜菜堿脫氫羅漢酸甲酯、黃酮苷、芹菜素、單寧、α-吡咯烷酮類和羊毛甾烷三萜[3-4]等，這些化合物表現(xiàn)多種藥理作用，包括抗真菌、抗炎、血管舒張以及抗病毒等[4-6]。研究表明，該植物的主要生物活性成分是黃酮、酚類[7]、三萜類化合物[8-9]和倍半萜[6]。在傳統(tǒng)的維吾爾醫(yī)學(xué)中，地錦草主要用于治療皮膚病[3]。藥理學(xué)研究表明，地錦草還具有抗炎[4]、抗氧化[5]、降血脂和降血糖[7]等作用，并且作為中藥提取物，地錦草應(yīng)用于臨床上具有副作用小、價格低廉等優(yōu)點。

癌癥是世界范圍內(nèi)的一個威脅人們健康的主要因素[10]。胃癌(gastric carcinoma，GC)是全球第五大常見癌癥和癌癥死亡的第二大原因，是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高轉(zhuǎn)移率，全世界每年約有幾十萬人因胃癌而死亡[11-12]。目前胃癌的治療是以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療，盡管近年來在胃癌診斷和治療方面都取得了重要進展，但胃癌的5年生存率，尤其是轉(zhuǎn)移性胃癌患者，仍然很低，亟待研究開發(fā)出新的有效治療措施和藥物，不斷探索新的胃癌治療方案?！吨兴帉W(xué)》記載地錦草對痢疾、胃炎、便血等胃腸道疾病具有明顯的治療效果，最近有研究證明地錦草還具有抗癌[6]作用，并且已經(jīng)在宮頸癌[16]和肝癌[24]等癌癥中得到證實，但未見地錦草應(yīng)用于胃癌的研究報道。因此本課題組擬研究地錦草乙醇提取物(ethanol extract from Euphorbia humifusa，EEEH)對胃癌細胞的作用，為開發(fā)胃癌治療新藥物提供新思路。本研究還深入探討了EEEH對增殖相關(guān)蛋白PCNA、抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BCL-XL以及促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的影響，初步研究地錦草乙醇提取物對體外胃癌細胞增殖活性的影響及其作用機制，為地錦草乙醇提取物應(yīng)用于胃癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人胃癌細胞株BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心，并于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購自Biological Industries(BI)公司，MTS細胞增殖分析試劑盒購自美國Promega公司，蛋白上樣緩沖液購自Takara公司，細胞周期試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，兔抗人BCL-2、BCL-XL、PCNA、caspase-8、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 地錦草乙醇提取物的制備

地錦草生藥購自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥房，秤取地錦草40 g，置于經(jīng)硫酸浸泡，高壓處理過的錐形瓶中，并添加400 mL的75%乙醇，蓋緊瓶塞，浸泡過夜。第二日，將錐形瓶置于100℃水浴鍋中并與回流裝置連接，蒸餾3 h，常溫冷卻，棄殘渣，取上清，濾紙過濾3次，12 000 r/min，5 min離心，經(jīng)旋轉(zhuǎn)凍干成粉后，取適量地錦草提取物，DMSO溶解，得到地錦草乙醇提取物原液，用不含牛血清和雙抗的1640培養(yǎng)基進行稀釋，一次性濾器過濾2次，備用。

1.3 細胞培養(yǎng)

將凍存于-80℃胃癌細胞株迅速移至37℃水浴箱中融化，細胞懸液移入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素-慶大霉素(三抗)的RPMI-1640培養(yǎng)基的無菌離心管內(nèi)，1 000 r/min，3 min離心，倒掉上清，吸取適量培基重懸，移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中，用胰蛋白酶消化細胞后傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4 預(yù)實驗

由于地錦草乙醇提取物相關(guān)文獻較少，研究人員的提取方式各異，因此，在正式進行實驗之前，我們進行預(yù)實驗以確定地錦草乙醇提取物對胃癌細胞株的最佳作用濃度。我們將用DMSO溶解的EEEH原液，用不含牛血清和不含三抗的1640培基進行稀釋，稀釋成多個濃度，用不同濃度的EEEH分別處理胃癌細胞，利用MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methox yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]實驗檢測不同濃度EEEH(62.5、125、250和500μg/mL)對胃癌細胞增殖的抑制作用，選取最終受試物濃度，以0.05%的DMSO作為溶劑對照。

1.5 MTS實驗檢測胃癌細胞存活率

胰蛋白酶消化細胞，培基終止消化，取對數(shù)生長期的細胞，1 000 r/min離心3 min，倒掉上清，加入少量培基重懸細胞，計數(shù)板計數(shù)，在96孔板中加入5×103個細胞，37℃孵育4 h，待細胞貼壁后，實驗組各孔分別加入不同濃度的地錦草乙醇提取物(62.5、125、250和500μg/mL)；空白對照孔加入完全培養(yǎng)基；溶劑對照孔加入0.05%的DMSO；每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)處理24、48、72 h后加入MTS試劑，反應(yīng)2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測492 nm波長處各孔的光密度D(492)值，計算抑制率，以時間為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制細胞生長柱狀圖，實驗重復(fù)3次。

1.6 顯微鏡觀察細胞形態(tài)

將用不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24、48、和72 h的胃癌細胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS分別放置于倒置相差顯微鏡下，觀察胃癌細胞的結(jié)構(gòu)完整性以及核仁的變化并拍照記錄。

1.7 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞周期分布

用胰蛋白酶消化經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24 h的各組胃癌細胞，培基終止消化，離心棄上清，PBS洗滌兩次，加入1 mL PI染料和10μL滲透液，混勻后避光孵育30 min，過濾網(wǎng)過濾后上機檢測各組細胞的G0/G1、S和G2/M的周期分布，實驗重復(fù)3次。

1.8 流式細胞術(shù)檢測胃癌細胞凋亡率

用胰蛋白酶消化經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)的地錦草乙醇提取物處理24 h的各組胃癌細胞，培基終止消化，離心棄上清，PBS洗滌兩次，加入5 μL Annexin V-PE和5μL 7-AAD，混勻后避光孵育15 min，流式細胞檢測各組的活細胞、死細胞、早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的數(shù)量，并計算各組細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.9 Western blot檢測胃癌細胞中增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達水平

選取胃癌細胞MGC803和AGS，用地錦草乙醇提取物濃度分別為62.5、125和250μg/mL處理胃癌細胞8、16和24 h后，RIPA裂解液提取各組細胞蛋白質(zhì)，BCA法進行蛋白定量，每孔取蛋白樣品70μg，進行10%SDS-PAGE，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入兔抗人BCL-2、BCL-XL、caspase-8、caspase-9、caspase-3(均按1∶1 000稀釋)、PCNA(1∶2 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入熒光二抗(1∶100 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，PVDF膜經(jīng)Odyssey紅外熒光成像儀掃描分析，實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 地錦草乙醇提取物抑制胃癌細胞的增殖

MTS實驗結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物分別處理胃癌細胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS 24、48和72 h后，與對照組相比其抑制率顯著升高(均P＜0.05)，500μg/mL的地錦草乙醇提取物處理上述4種GC細胞72 h的抑制率分別可達(79.1±0.5)%、(78.3±1.1)%、(56.5±0.6)%和(47.5±1.2)%。

A：BGC823細胞；B：MGC803細胞；C：SGC7901細胞；D：AGS細胞.與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖1 不同濃度的地錦草乙醇提取物對胃癌細胞的增殖抑制率

2.2 地錦草乙醇提取物影響胃癌細胞形態(tài)

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果見圖2，可見經(jīng)不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物處理24、48和72 h的胃癌細胞BGC823、MGC803、SGC7901以及AGS的細胞形態(tài)與對照組相比有顯著差異，可見更多數(shù)量細胞皺縮，核深染，部分細胞胞膜破裂壞死。

A：BGC823細胞；B：MGC803細胞；C：SGC7901細胞；D：AGS細胞.圖2 不同濃度的地錦草乙醇提取物處理后胃癌細胞的形態(tài)學(xué)觀察(×10)

2.3 地錦草乙醇提取物影響胃癌細胞周期分布

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖3，可見經(jīng)不同濃度(62.5、125和250μg/mL)地錦草乙醇提取物處理24 h后，AGS細胞的G0/G1期比例顯著高于對照組，而S期和G2/M期細胞比例沒有明顯變化，250μg/mL地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)的AGS細胞G0/G1期比例最高可達(68.2±0.8)%，而MGC803細胞的各期比例沒有顯著變化。

A：流式細胞術(shù)檢測MGC803細胞的周期分布；B：流式細胞術(shù)檢測AGS細胞的周期分布；C：MGC803細胞的周期分布統(tǒng)計圖；D：AGS細胞的周期分布統(tǒng)計圖.與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖3 流式細胞術(shù)檢測地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細胞周期分布

2.4 地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示與對照組相比，經(jīng)不同濃度地錦草乙醇提取物(62.5、125、250μg/mL)處理24 h的MGC803細胞和AGS細胞的凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)，250μg/mL地錦草乙醇提取物誘導(dǎo)的MGC803細胞和AGS細胞凋亡率可達(16.3±0.6)%和(19.9±1.1)%。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)(圖5)，可見細胞出現(xiàn)皺縮，核深染，部分細胞胞膜破裂等凋亡樣改變，證明了流式細胞術(shù)的結(jié)果。

A：流式細胞術(shù)檢測MGC803細胞的凋亡率；B：流式細胞術(shù)檢測AGS細胞的凋亡率；C：MGC803細胞的凋亡率統(tǒng)計圖；D：AGS細胞的凋亡率統(tǒng)計圖.與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖4 地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細胞凋亡率檢測

A：MGC803細胞；B：AGS細胞.圖5 地錦草乙醇提取物處理24 h后的胃癌細胞凋亡的形態(tài)觀察

2.5 地錦草乙醇提取物影響胃癌細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果見圖6，可見與對照組相比，經(jīng)地錦草乙醇提取物(62.5、125和250μg/mL)處理的胃癌細胞中PCNA、BCL-2和BCL-XL的蛋白表達水平顯著降低，caspase-8和caspase-3的蛋白表達水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而caspase-9的蛋白表達水平無明顯變化。

3 討論

A：Western blot檢測MGC803細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達；B：Western blot檢測AGS細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達；C：MGC803細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平統(tǒng)計圖；D：AGS細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平統(tǒng)計圖.與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.圖6 地錦草乙醇提取物影響胃癌細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

世界上每年有近100萬人新診斷為胃癌，超過1/3比例人數(shù)發(fā)生在中國[12-13]。根治性胃切除術(shù)是治療胃癌的唯一療法[7，14]，然而，手術(shù)創(chuàng)傷會影響到胃腸蠕動和消化功能，還會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)。因此近年來，中藥在癌癥的臨床治療中被廣泛應(yīng)用[15]。2017年，江濤等人證實地錦草提取物能夠抑制宮頸癌Hela細胞的增殖，其主要是通過誘導(dǎo)Hela細胞的凋亡實現(xiàn)的[16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，地錦草可能通過抑制NF-κB信號通路的活化，下調(diào)腫瘤中VEGF的表達，從而抑制腫瘤血管生長，改變腫瘤微環(huán)境，達到抑制腫瘤的作用[17]，并且，Soon等人研究發(fā)現(xiàn)，來自地錦草的乙酸乙酯部分通過抑制NF-κB介導(dǎo)的MMP-9的基因表達對TNFα誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231乳腺癌細胞的侵襲具有預(yù)防作用[18]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，從地錦草中分離的異戊烯基查爾酮，在體外對人癌細胞系的生長具有顯著的抑制作用，并在人乳腺癌中誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬[19]。作為一味常用中藥地錦草還有很多其他重要的藥理作用，曹瑞珍等人發(fā)現(xiàn)，地錦草中提取的總黃酮能夠通過抗氧化作用延緩衰老[20]。還有研究證實，地錦草的黃酮類成分具有抗菌[21-22]、抗炎[23]以及抗病毒等功效[9]。綜上所述，地錦草能夠通過多種機制發(fā)揮抑制腫瘤的效應(yīng)，具有臨床應(yīng)用前景。

在本研究中，我們主要通過MTS細胞增殖實驗，流式細胞術(shù)以及Western blot實驗探究地錦草乙醇提取物對胃癌細胞增殖活性的抑制作用及其作用機制。MTS結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度(62.5、125、250和500μg/mL)地錦草乙醇提取物處理過的胃癌細胞，其增殖活力顯著降低，其中500μg/mL的地錦草乙醇提取物處理胃癌細胞72 h的抑制率高達(79.09±0.5)%，Western blot結(jié)果也證實，與對照組相比，經(jīng)地錦草乙醇提取物處理的胃癌細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA表達水平降低；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同濃度(62.5、125和250μg/mL)地錦草乙醇提取物處理胃癌細胞MGC803和AGS 24 h后，其凋亡率明顯升高，Western blot結(jié)果也證實，經(jīng)地錦草乙醇提取物處理的胃癌細胞抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BCL-XL表達水平降低，而促凋亡相關(guān)蛋白caspase-8和caspase-3出現(xiàn)裂解片段，表明細胞凋亡活性增強，顯微鏡下可觀察到胃癌細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，證實了這一結(jié)果。流式細胞術(shù)結(jié)果還顯示，地錦草乙醇提取物可將AGS細胞周期阻滯在G0/G1期，但對胃癌細胞MGC803的周期并沒有產(chǎn)生明顯影響，我們猜測，這可能與地錦草乙醇提取物阻斷不同種類胃癌細胞系進展的方式不同相關(guān)。以上結(jié)果證實，地錦草乙醇提取物通過促進胃癌細胞的凋亡，將細胞周期阻滯在G0/G1期，并且抑制胃癌細胞增殖相關(guān)蛋白和抗凋亡相關(guān)蛋白的表達，誘導(dǎo)促凋亡相關(guān)蛋白的表達，在體外發(fā)揮抑制胃癌細胞增殖活性的作用。

綜上所述，EEEH能夠抑制胃癌細胞的增殖，影響細胞周期分布以及誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡，并且我們猜測其抑癌作用可能是通過誘導(dǎo)胃癌細胞的凋亡實現(xiàn)的，提示EEEH能夠通過抑制抗凋亡相關(guān)蛋白的表達，促進凋亡蛋白的表達來抑制胃癌細胞的增殖，為進一步探索EEEH在胃癌進展中的作用機制提供了研究基礎(chǔ)。