益母草抗結核分枝桿菌成分的跟蹤分離

韓立芬，宋善敏，甘夢蘭，王仁鳳，楊再昌

貴州大學藥學院，貴陽 550025

結核(tuberculosis,TB)是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的可侵犯全身各器官的一種慢性傳染病。結核分為肺結核和肺外結核，其中女性盆腔結核近年來有增長的趨勢[1，2]。女性盆腔結核是指女性盆腔包括盆腔生殖器官(卵巢、輸卵管、子宮)及盆腔腹膜與子宮周圍的結締組織的炎癥?；颊呖沙霈F(xiàn)消瘦、疲勞、發(fā)燒、出汗、乏力等癥狀，常伴隨盆腔痛、月經異常、痛經、閉經、月經量少等癥狀，是導致女性不孕的重要原因[3-6]。目前，主要使用抗癆藥物對女性盆腔結核實施治療,一線抗結核藥物缺乏子宮靶向性，必須長期服藥,由于這類藥物肝毒性明顯,患者往往不能堅持服藥,導致治療失敗。因此，研發(fā)子宮靶向性的抗結核新藥對盆腔結核的治療具有重要意義。

益母草是唇形科益母草屬植物益母草(Leonurusartemisia(Laur.)S.Y.Hu F)的新鮮或者干燥地上部分。古代文獻將益母草的功效歸屬于治療婦產科疾病，比如：《本草衍義補遺》說“益母草治產前產后諸疾”、《本草綱目》說“益母草治婦人胎產諸病”、《本草蒙筌》說“益母草總調胎產諸證”、《本草求真》說“益母草消水行血，去瘀生新，調經解毒，為胎前胎后要劑”。在現(xiàn)代醫(yī)學實踐中，益母草被制成“益母草膏”、“益母草顆?！?、“益母草注射液”等劑型 ，用于治療痛經、閉經、子宮陰道出血，具有促進產后子宮復舊及清理產后子宮殘留物等功效[7-14]?？梢?，益母草對子宮及其附件的多種病理過程具有明顯的干預作用，那么，益母草是否具有子宮靶向性、是否具有抗子宮結核的作用？迄今少見相關的文獻報道。

為發(fā)現(xiàn)具有子宮靶向性的抗結核藥物，我們對20多種具有治療女性盆腔類疾病的中草藥進行了抗結核桿菌體外試驗，部分品種顯示出抗結核桿菌活性，其中益母草乙醇提取物在改良羅氏培養(yǎng)基中能抑制結核分枝桿菌生長。對益母草進行抗結核分枝桿菌活性跟蹤分離，得到活性單體YMC04，報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材

益母草(2 700 g)購自貴陽市和平藥房，為除根外的細葉益母草全株。

1.2 儀器與試劑

核磁共振數(shù)據(jù)用INOVA400 MHz型超導核磁共振儀測定，TMS作內標；質譜數(shù)據(jù)用HP-5973型質譜儀測定；柱色譜用硅膠(200～300目)、硅膠H和薄層色譜用硅膠GF254均為青島海洋化工產品；改良羅氏培養(yǎng)基基礎(上海博微生物科技有限公司)，7H9肉湯(Difco)，其余試劑均為國產分析純。

1.3 益母草的提取與活性跟蹤分離

1.3.1 益母草的提取與分段

益母草樣品2 700 g用80%的乙醇加熱回流提取三次，每次一小時，合并提取液，過濾，置于70℃水浴蒸干，得乙醇提取物浸膏140 g。浸膏用10%乙醇水溶液溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位(45 g)、乙酸乙酯部位(40 g)、二氯甲烷部位(8 g)、剩余物(49 g)，不同萃取部位用改良羅氏培養(yǎng)基絕對濃度法進行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、二氯甲烷萃取部位能抑制結核桿菌，乙酸乙酯萃取部位活性更強，因此將乙酸乙酯萃取部位視為有效部位。

1.3.2 益母草乙酸乙酯萃取部位的活性跟蹤與分離

乙酸乙酯萃取部位用硅膠柱色譜(200～300目)分離，干法裝柱，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯(4∶1～3∶2)進行梯度洗脫，最后甲醇沖柱，經TLC檢測，合并相似成分,得到六個組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)(圖1)。利用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)有效組分為Fr.C(22-33)。

圖1 益母草乙酸乙酯萃取部位的分離Fig.1 Separation of ethyl acetate extract from Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

1.3.3 Fr.C的活性跟蹤與分離

Fr.C進行硅膠柱色譜(200～300目)分離，用二氯甲烷：甲醇(20∶1～15∶1)作洗脫劑進行梯度洗脫，得到四個組分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4)(圖2)。

利用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，有效組分為Fr.2。Fr.2經硅膠柱色譜多次純化，得到單體YMC04(化合物1，400 mg)。

1.4 抗結核分枝桿菌測試絕對濃度法

改良羅氏培養(yǎng)基 40.84 g，加入12 mL的甘油，加蒸餾水600 mL煮沸5～10 min，115 ℃滅菌 20 min，待冷至55 ℃左右時以無菌操作加入1 000 mL無菌攪勻的全蛋液，混勻，分裝在15 mm×150 mm 的試管，每管5 mL[15]。稱取樣本，用二甲基亞楓(DMSO)溶解，分別加入到含有改良羅氏培養(yǎng)基試管中，根據(jù)預實驗確定濃度，每個濃度做3管，平行做2次，陽性對照為異煙肼(2 μg/mL)，陰性對照為含5% DMSO的無藥培養(yǎng)基，放置成斜面，80 ℃下加熱滅菌1 h，隔夜后相同條件下加熱滅菌1 h，冷卻后接種H37Rv菌懸液(108CFU/mL) 20 μL，使菌液由上往下分布在培養(yǎng)基斜面上，置 37 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天。在培養(yǎng)期間，每天觀察記錄一次。結果判斷：菌落數(shù)低于5個(含5個)視為有效，其中菌落0～1個記“+++”，2～4個記“++”，5個記“+”，菌落數(shù)在6個以上(含6個)視為無效，記“-”。

圖2 Fr.C的分離Fig.2 Separation of Fr.C

2 結果

2.1 活性跟蹤

采用改良羅氏培養(yǎng)基絕對濃度法對益母草乙醇提取物不同萃取部位進行活性測試，結果見表1，可見活性最強的部位為乙酸乙酯萃取物。

表1 益母草不同萃取部位的活性跟蹤Table 1 Bioassay of different extraction parts of Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

乙酸乙酯萃取部位經硅膠柱色譜分離，得到六個組分(Fr.A、Fr.B、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F)，采用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，確定Fr.C為活性部位(表2)，其抑制結核桿菌的MIC值為0.4 mg/mL。

表2 益母草乙酸乙酯部位的活性跟蹤Table 2 Bioassay of ethyl acetate fraction in Leonurus artemisia (Laur.)S.Y.Hu F

Fr.C進一步進行硅膠柱色譜分離得到活性組分Fr.2，F(xiàn)r.2再經硅膠柱色譜反復純化，得到活性單體化合物1，經改良羅氏培養(yǎng)基進行活性測試，化合物1的MIC值為80 μg/mL。

2.2 結構鑒定

化合物1白色針晶(MeOH)；mp.195～196 ℃。1H NMR (400 MHz，CD3OD ) δ (ppm)：7.26 (s,2H),5.07 (s,2H),4.33 (t,J=12 Hz,4 Hz,2H),3.83 (s,6H),3.49 (s,1H),3.38 (dt,J=6 Hz,4 Hz,2H),3.31 (p,J=4 Hz,2H),3.29 (s,1H),3.27 (s,1H),1.86 (m,2H),1.76 (m,2H)。ESI-MS：m/z312 [M+H]+。經薄層層析，用改良的碘化鉍鉀顯色呈磚紅色。與益母草堿對照品經TLC檢測，其Rf值一致，氫譜、質譜數(shù)據(jù)與文獻[16]對照基本一致，確定化合物1為益母草堿(圖3)。

圖3 益母草堿結構式Fig.3 Structural formula of leonurine

3 討論

益母草常用于月經不調，痛經閉經，惡露不盡，瘡瘍腫毒等癥，是婦科疾病的常用藥。益母草的化學成分主要有生物堿(益母草堿、水蘇堿、益母草啶、益母草寧)、黃酮類、二萜類、環(huán)形多肽、阿魏酸等小分子化合物[17]。益母草堿的藥理作用較多，具有舒張冠脈、抑制ATP的合成、抑制炎癥因子的信號通路、抑制糖異生、促進子宮收縮等作用[18]。目前未見益母草堿抗結核桿菌活性的報道。

從結構上看，益母草堿(3，5-二甲氧基-4-羥基-苯甲酸 (4-胍基)-1-丁酯)屬于有機胺類生物堿，含有三個N原子，與一線抗結核藥物異煙肼類似，異煙肼同樣含有3個N原子，一個N組成吡啶環(huán)，另外兩個N原子形成肼基，而在益母草堿中，三個N原子以胍基的形式存在，由此我們推測，益母草堿抗結核桿菌機制可能與異煙肼類似。

在我們的初步試驗(尚未報道)中發(fā)現(xiàn)，益母草堿在大鼠子宮及其附件中的分布大于異煙肼，這一結果有待擴大樣本量進一步證實。同時我們擬對益母草堿進行結構修飾，提高其抗結核桿菌活性并增加其在子宮中的分布，為治療子宮結核提供新的線索。