新疆地區(qū)一株羊駝源鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析

井郁金 金映紅 參都哈西·加吾丁 王杰 趙潔雅 馬文戈 黃炯 夏俊

摘? ? 要：為了解新疆北部某羊駝養(yǎng)殖場(chǎng)病死羊駝的病因，從死亡羊駝的肝臟及其心臟血液樣品中分離培養(yǎng)病原菌。本試驗(yàn)采用細(xì)菌分離、革蘭氏染色、生化反應(yīng)鑒定和PCR試驗(yàn)鑒定，進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)和抗菌藥的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，球菌，生化指標(biāo)和PCR結(jié)果均與鏈球菌相符。序列結(jié)果表明，分離株為鏈球菌，與一株新型的鏈球菌（序列號(hào)為NR_159140.1）同源性最高;動(dòng)物致病性試驗(yàn)中白兔接種100 μL·只-1，均在72 h內(nèi)死亡，病死率為100%。藥敏試驗(yàn)表明，分離株對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、頭孢曲松鈉、替米考星均敏感，而對(duì)克林霉素和氨芐西林有一定的耐受性。本試驗(yàn)從羊駝上分離得到的病原菌為新型的鏈球菌屬成員，這為新疆地區(qū)羊駝鏈球菌的分子流行病學(xué)以及防治鏈球菌病提供參考。

關(guān)鍵詞：羊駝;鏈球菌;分離鑒定;藥敏試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.299? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.010

Identification and Drug Resistance Analysis of Streptococcus Isolated from Alpaca? in Xinjiang

JING Yujin1， JIN Yinghong2， JIAWUDING·Canduhaxi2， WANG Jie2， ZHAO Jieya1， MA Wenge2， HUANG Jiong2， XIA Jun2

（1.College of Animal Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830009， China; 2.Veterinary Research Institute of Xinjiang Academy of Animal Science（Animal Medical Research Center of Xinjiang Academy of Animal Science），Urumqi， Xinjiang 830011，China）

Abstract： In order to understand the cause of dead alpacas in an alpaca farm in northern Xinjiang， pathogenic bacteria were isolated and cultured from dead alpaca liver and heart blood samples. This test used the methods of bacterial isolation， Gram staining， biochemical reaction identification， and PCR test identification to conduct animal pathogenicity tests and antimicrobial sensitivity tests. The results showed that Gram staining was positive， cocci， biochemical indicators and PCR results were consistent with streptococcus. The sequence results showed that the isolate was streptococcus， which has the highest homology with a new strain of streptococcus.（NR_159140.1） In the animal pathogenicity experiment， white rabbits were inoculated with 100 μL·head-1， and all died within 72 h. The case fatality rate was 100%. The drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to ciprofloxacin， levofloxacin， gentamicin， ceftriaxone sodium， azithromycin， flufenicol， ceftriaxone sodium， and telmicoxin， but clindamycin and ampicillin had a certain tolerance. The pathogenic bacteria isolated from alpaca in this experiment were members of the new streptococcus， which provided a reference for the molecular epidemiology of streptococcus from alpaca in Xinjiang and the prevention and treatment of streptococcosis.

Key words： alpaca; streptococcus; isolation and identification; drug seasitirity test

羊駝（Alpaca）原產(chǎn)于南美洲的安第斯山脈，又叫南美小型駝，別名美洲駝[1]。目前，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，新疆羊駝的存欄量為400只左右[2]，現(xiàn)在研究者對(duì)羊駝的疾病防控認(rèn)識(shí)不充分，研究不深入。

鏈球菌在自然界中分布非常廣泛，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，是有莢膜多呈雙球形的細(xì)菌，間或有4～6個(gè)短鏈，偶見(jiàn)個(gè)別單球散在分布。其可致多種動(dòng)物發(fā)病，易感動(dòng)物是綿羊，山羊次之[3]。近年在駱駝上有少數(shù)報(bào)道[4- 5]，均表現(xiàn)為后肢球結(jié)下感染，出現(xiàn)潰瘍面或化膿皰，關(guān)節(jié)腫大，但羊駝因鏈球菌病致死的國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)到報(bào)道[6-7]。

2019年1月，實(shí)驗(yàn)室收到新疆伊犁地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)死亡羊駝的病料。該養(yǎng)殖場(chǎng)羊駝存欄量35只，在不到一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)4只死亡。死亡前出現(xiàn)全身性出血性敗血癥及漿液性肺炎與胸膜肺炎等癥狀。在2018年11—12月期間，共發(fā)病死亡羊駝4只。發(fā)病羊駝均表現(xiàn)出精神萎靡、食欲不振、咳嗽等;剖檢后可見(jiàn)敗血癥病變，大葉性肺炎、肺肝變、肝臟腫大、膽囊腫大等。經(jīng)過(guò)病原分離、培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)致病力和生化試驗(yàn)等初步認(rèn)為病原為鏈球菌，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果與鏈球菌的同源性高達(dá)97%。本次試驗(yàn)為羊駝健康養(yǎng)殖和對(duì)羊駝鏈球菌感染的診斷和治療有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 病料采集 按照無(wú)菌操作要求采集病死羊駝的心臟、肝臟和肺臟。

1.1.2 主要試劑 BHI培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;革蘭氏染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;TAE、DL-2000 DNA Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，生化試劑及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 長(zhǎng)耳白兔4只，體質(zhì)量（3±0.2） kg，購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)? 無(wú)菌取少量的羊駝心臟血液直接接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～20 h;同時(shí)將剪取的肝臟和肺臟病料接種于BHI液體培養(yǎng)基和涂抹于BHI瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～20 h。觀察菌落顏色和形態(tài)特征，并挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)單菌落。

1.2.2 染色鑒定 取少量培養(yǎng)物進(jìn)行涂片與革蘭氏染色、顯微鏡下觀察及純化，將菌接種于BHI液體中留用，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化反應(yīng)試驗(yàn) 取適量純化培養(yǎng)的菌置于生化反應(yīng)管中進(jìn)行一系列的生化試驗(yàn)鑒定，37 ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]，設(shè)計(jì)細(xì)菌通用鑒定引物一對(duì)，上游5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-ACGGTTACCTTGTT

ACGACTT-3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將鏡下檢測(cè)的純培養(yǎng)物作為DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共50 μL：2×Taq PCR Master mix為25 μL;引物為2 μL，模板為1 μL;超純水22 μL;擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min;共30個(gè)循環(huán);延伸需要72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL于1%的瓊脂糖凝膠膠孔中點(diǎn)樣后電泳，并在成像儀內(nèi)成像進(jìn)行鑒定。

1.2.5 16S rRNA基因序列測(cè)序 將所獲得的PCR產(chǎn)物測(cè)序，挑選不同種鏈球菌的16S rDNA基因序列，應(yīng)用GenBank中的已知核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，用MEGA X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 把純培養(yǎng)物37 ℃搖菌18 h左右，制備成懸液。將試驗(yàn)的健康白兔4只，隨機(jī)分成2組，每組2只。試驗(yàn)組白兔采取靜脈注射菌液100 μL·只-1（約2.9×108 CFU·mL-1），對(duì)照組注射等量的生理鹽水。每隔12 h觀察發(fā)病和死亡情況，并詳細(xì)記錄。

1.2.7 藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)無(wú)菌操作嚴(yán)格要求[9]。將分離菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)18～20 h后，用移液器取200 μL菌液，用滅菌玻璃棒均勻涂布于平板，待平板中的液體完全吸收后，選取常用的10種抗菌藥物紙片貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，每張藥敏片間的距離盡量均等，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，對(duì)產(chǎn)生的抑菌圈直徑和判定標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

病料均勻涂于平板后，該菌在BHI瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落扁平、濕潤(rùn)、透明、微?。▓D1）。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

革蘭氏染色鏡檢：組織涂片在鏡下可見(jiàn)藍(lán)色成雙排列的球菌。用取菌環(huán)釣取純培養(yǎng)物染色鏡檢，可見(jiàn)染色為革蘭氏陽(yáng)性的球菌，成單/雙出現(xiàn)，或短鏈狀排列（圖2）。

2.3 生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)手冊(cè)》的參考標(biāo)準(zhǔn)和鏈球菌陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株的生化結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果符合鏈球菌的特征，分離株的生化特性結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

待電泳結(jié)束后在凝膠成像儀內(nèi)呈像，拍照并保存圖片。結(jié)果：擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的目的條帶，大小為1 470 bp的片段，見(jiàn)圖3。

2.5 16S rRNA基因序列分析

將測(cè)定的序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（ http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST）進(jìn)BLAST搜索比對(duì)，其基因序列顯示為鏈球菌屬。用MEGA軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，該菌與從綿羊乳房皮下膿腫分離的新型鏈球菌屬（streptococcus ovuberis strain，序列號(hào)為NR_159140.1）的同源性最高，可以達(dá)到97%;將分離株標(biāo)記為SXJA1，可以確認(rèn)該菌株是鏈球菌屬（圖4）。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

接種后8 h試驗(yàn)組中的白兔精神不佳，活動(dòng)減少。在接種72 h后全部死亡（圖5）。對(duì)照組接種72 h后的白兔均健康存活著。從死亡白兔的心臟血、肝臟中均分離到革蘭氏染色鏡檢出現(xiàn)大量呈鏈狀排列的藍(lán)紫色的球菌，與接種的菌株形態(tài)相同;該菌株對(duì)白兔具有致病性。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

在試驗(yàn)所用的10種藥物中，分離株僅對(duì)克林霉素和氨芐西林耐藥。對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松鈉、阿奇霉素、氟苯尼考、頭孢曲松鈉、替米考星均敏感（表2）。

3 結(jié)論與討論

羊駝的鏈球菌病是由鏈球菌屬的細(xì)菌引起羊駝出現(xiàn)敗血癥的一種傳染病[10]，多為散發(fā)。目前主要的防控措施是藥物殺菌。根據(jù)本養(yǎng)殖場(chǎng)的疫病疫情分析中發(fā)現(xiàn)，主要的臨床癥狀與剖檢結(jié)果是菌血癥和敗血癥。從發(fā)病到死亡，病程短暫，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，疑似細(xì)菌所致。為有效控制該病的傳播和擴(kuò)散，及時(shí)進(jìn)行了病原體的分離和鑒定。傳統(tǒng)鑒定細(xì)菌主要是以生物學(xué)特征為基礎(chǔ)，按照細(xì)菌的形態(tài)、生化特點(diǎn)等進(jìn)行分類(lèi)，但是卻因環(huán)境、培養(yǎng)條件等因素影響，結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性都存在較大差異。筆者采用基因部分序列的分析，可以從分子水平上確定出病原體。從養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病情況，結(jié)合病死羊駝病料的剖檢變化，細(xì)菌培養(yǎng)和核苷酸序列的測(cè)定等，最終可判定導(dǎo)致羊駝死亡的主要病原是鏈球菌。剖檢有肺炎特征，實(shí)驗(yàn)室也做了有關(guān)支原體的檢測(cè)，結(jié)果為陰性，故排除了支原體的感染，可以確診羊駝感染鏈球菌引發(fā)肺炎而致死。

在進(jìn)化樹(shù)分析中分離菌SXJA1與分離株VB15-00779T的同源性最高[11]，文獻(xiàn)描述這是新型的未鑒定種的鏈球菌，與莫氏鏈球菌和駱駝鏈球菌的親緣關(guān)系最近，是鏈球菌屬的一個(gè)新的種。由于是一新型的菌株，目前的研究和參考文獻(xiàn)比較少，受條件因素影響的限制，未能繼續(xù)研究。

鏈球菌在環(huán)境中的存在十分廣泛，大部分都不具有致病性。在綜合全面地考慮問(wèn)題時(shí)，環(huán)境因素也不容忽視。在新疆各地均存在致病性鏈球菌發(fā)病的報(bào)道[12]，尤其是未達(dá)到規(guī)?；B(yǎng)殖條件的場(chǎng)所。糞便污染和環(huán)境的臟亂差是主要的原因。隨著羊駝養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖羊駝也在迅速的發(fā)展，但是養(yǎng)殖新技術(shù)還需不斷完善。此次病死羊駝必須深埋，同時(shí)環(huán)境需要徹底消毒，防止該病的再次發(fā)生。

本試驗(yàn)分離的菌株確診為羊駝源的鏈球菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室一系列的分離鑒定使得這次發(fā)病的診斷更加快速和精準(zhǔn)。藥物的耐藥性試驗(yàn)與分析中，該分離株的耐藥藥物只有兩種，對(duì)青霉素類(lèi)和林可酰胺類(lèi)耐藥，所以可以選擇其他種類(lèi)的抗生素進(jìn)防治。藥敏試驗(yàn)也較為快速有效地檢測(cè)出菌株對(duì)各種抗菌藥的敏感性，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供了一個(gè)方向，方便靈活選藥，選出最敏感的藥物。羊駝作為產(chǎn)毛型動(dòng)物在未來(lái)有很高的經(jīng)濟(jì)前景[13]，在新疆畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過(guò)程中，羊駝的常見(jiàn)傳染病需要慢慢摸索和研究。分離到的鏈球菌能為后續(xù)相關(guān)的研究提供數(shù)據(jù)支持，試驗(yàn)為新疆羊駝養(yǎng)殖中鏈球菌病的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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