脯氨酰羧基肽酶和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2在IgA腎病中的表達(dá)及其病理意義*

徐晉徉， 何常， 胡斌

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550004)

IgA腎病是最常見的原發(fā)性腎小球疾病[1]，其病理特征為腎活檢免疫病理顯示IgA或以IgA為主的免疫球蛋白及補(bǔ)體成分在腎小球系膜區(qū)呈彌漫性顆粒狀或團(tuán)塊狀沉積，有時(shí)可伴有毛細(xì)血管袢沉積，可引起一系列的臨床及病理改變[2]， 20%～40%的IgA腎病患者在20年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease，ERSD)[3-4]。腎臟組織中除經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，即循環(huán)RAS外，還有著獨(dú)立的RAS系統(tǒng)。有研究顯示，獨(dú)立的RAS系統(tǒng)可能與腎臟的炎癥疾病存在一定關(guān)系[5-6]。本研究以RAS系統(tǒng)為中心，選擇RAS系統(tǒng)的2個(gè)相關(guān)蛋白脯氨酰羧基肽酶(prolylcarboxypeptidase，PRCP)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)為研究對(duì)象，觀察其在IgA腎病患者的腎穿刺組織中的表達(dá)，分析PRCP、ACE2表達(dá)與各類型IgA腎病病變程度的關(guān)系，探討RAS系統(tǒng)在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 收集54例醫(yī)院病理科經(jīng)腎穿刺活檢明確診斷為IgA腎病患者的腎活檢組織標(biāo)本作為IgA腎病組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有標(biāo)本由一位高級(jí)職稱病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，所有標(biāo)本均經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色、六胺銀(PASM)染色、馬松三色(Masson)染色、過碘酸雪夫(PAS)染色、結(jié)合IgG、IgA、IgM、C3、C1q、Fib、HbsAg、HbcAg、HP等免疫熒光染色以及電鏡確診為IgA腎病。排除由糖尿病、過敏性紫癜、乙型肝炎感染、肝硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等系統(tǒng)性疾病引起的繼發(fā)性腎小球疾病，排除先天性遺傳性腎臟疾病，排除在本次腎臟穿刺明確診斷前有血管緊張素2受體阻滯劑(angiotensin receptor blocker，ARB)或血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)使用史患者，排除缺乏新鮮組織免疫熒光結(jié)果而采用石蠟組織免疫熒光輔助診斷者，排除光鏡檢查腎小球數(shù)量較少者及臨床病理資料不完整者。54例IgA腎病組患者，男34例、女性20例，年齡12～76歲、中位年齡35歲；按其病變程度分型，局灶增生型20例、IgA腎病合并膜性腎病(membranous nephropathy，MN)20例、新月體型14例。另隨機(jī)抽取20例經(jīng)腎活檢確診為微小病變腎病(minimal change disease，MCD)患者為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)與IgA腎病組相一致，其中男16例、女4例，年齡13～65歲、中位年齡33歲。

1.1.2試劑及方法 一抗：兔抗人多克隆抗體PRCP(工作濃度1 ∶200)，兔抗人多克隆抗體ACE2(工作濃度1 ∶200)購自北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；二抗：通用二步法試劑盒PV-5000，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1PRCP、ACE2表達(dá) 按照試劑盒說明書采用免疫組化法檢測2組的腎穿刺組織的PRCP、ACE2表達(dá)，切片染色時(shí)使用PBS緩沖液替代一抗進(jìn)行操作作為陰性對(duì)照。

1.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 每個(gè)標(biāo)本切片分別選取腎小球區(qū)和腎小管區(qū)2個(gè)部位分別進(jìn)行評(píng)估。(1)腎小管區(qū)：在顯微鏡下放大400倍攝取隨機(jī)腎小管視野10個(gè)/高倍鏡，對(duì)所選視野陽性信號(hào)用Image-pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析；以積分光密度(integral optical density，IOD)該值表示該成分在腎小管間質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量[7-8]。(2)腎小球區(qū)：以陽性腎小球所占百分比和其染色強(qiáng)度2項(xiàng)評(píng)分之積來判斷表達(dá)程度[9]，染色強(qiáng)度分為4級(jí)評(píng)分，不著色(-)計(jì)1分，淺黃色(+)計(jì)2分，棕黃色(++)計(jì)3分，黃褐色(+++)計(jì)4分；陽性腎小球所占百分比分為6級(jí)評(píng)分，無陽性腎小球計(jì)0分，陽性率 ≤20%計(jì)1分，陽性率 21% ～40%計(jì)2分，陽性率 41%～60%計(jì)3分，陽性率 61%～80%計(jì)4分，陽性率≥81%計(jì)5分。每張切片分別由2位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理科醫(yī)生單獨(dú)讀片，當(dāng)2者之間存在差異時(shí)，通過同時(shí)使用雙頭顯微鏡以達(dá)成共識(shí)。(3)新鮮組織免疫熒光示免疫球蛋白及補(bǔ)體成分沉積量評(píng)估分為5級(jí)進(jìn)行評(píng)分：(-)計(jì)0分、(+)計(jì)1分、(++)計(jì)2分、(+++)計(jì)3分、(++++)計(jì)4分[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間分析采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-WallisH檢驗(yàn))；采用Spearman分析IgA腎病組PRCP、ACE2表達(dá)與各類型IgA腎病病變程度的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRCP、ACE2在腎組織中的分布

IgA腎病的鏡下改變呈多樣性，除系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生以外，可以表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞增生、節(jié)段性硬化、新月體形成等，亦可見腎小管上皮細(xì)胞空泡和顆粒變性、刷狀緣脫落、萎縮及腎間質(zhì)水腫、纖維化等(見圖1)。在對(duì)照組和IgA腎病組的腎組織中PRCP、ACE2均有不同程度的表達(dá)，在腎小管及間質(zhì)區(qū)域中主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞，以胞質(zhì)及胞膜為主，棕黃色呈彌散性分布，在腎間質(zhì)血管中未見明顯表達(dá)；在腎小球區(qū)域腎小球壁層、臟層上皮細(xì)胞均有表達(dá)，以胞膜為主，棕黃色呈線性或顆粒性分布，在新月體中增生的壁層上皮細(xì)胞多數(shù)呈高表達(dá)(見圖2及圖3)。

注：A為細(xì)胞性新月體，B為腎小管上皮細(xì)胞空泡和顆粒變性。

圖1 IgA腎病的腎小球和腎小管病變
Fig.1 Glomerular and tubular lesions in IgA nephropathy

2.2 PRCP在腎小管區(qū)和腎小球區(qū)的表達(dá)

2.2.1腎小管區(qū) 經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IgA腎病組PRCP蛋白在腎小管區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.455，P<0.05)；進(jìn)一步比較PRCP蛋白在腎小管區(qū)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者顯著高于對(duì)照組患者(P<0.05)，IgA腎病組中新月體患者與對(duì)照組比較、局灶增生患者與合并MN患者比較、局灶增生患者與新月體患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。提示PRCP在IgA腎病患者腎小管區(qū)的表達(dá)高于MCD患者，但隨著疾病的進(jìn)展至新月體型IgA腎病后，PRCP在腎小管區(qū)的表達(dá)下降至MCD患者水平。見圖2及圖4。

2.2.2腎小球區(qū) 經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IgA腎病組PRCP蛋白在腎小球區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=52.501，P<0.05)；進(jìn)一步比較PRCP蛋白在腎小球區(qū)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者、新月體患者均顯著高于對(duì)照組患者(P<0.05)，新月體患者顯著高于局灶增生患者、合并MN患者(P<0.05)。提示PRCP在IgA腎病患者腎小球區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組患者，但隨著疾病的進(jìn)展，PRCP在腎小球區(qū)的表達(dá)量逐漸升高。見圖2及圖4。

2.3 ACE2在腎小管區(qū)和腎小球區(qū)的表達(dá)

2.3.1腎小管區(qū) 經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IgA腎病組ACE2蛋白在腎小球區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=23.669，P<0.05)；進(jìn)一步比較ACE2蛋白在腎小管區(qū)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IgA腎病組中局灶增生患者顯著高于合并MN患者和對(duì)照組患者(P<0.05)，對(duì)照組與合并MN患者比較、局灶增生患者與合并MN患者比較、局灶增生患者與新月體患者比較、合并MN患者與新月體患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示ACE2僅在局灶增生型IgA腎病患者的腎小管區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組患者。見圖3及圖5。

2.3.2腎小球區(qū) 經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，IgA腎病組ACE2蛋白在腎小球區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=56.087，P<0.05)；進(jìn)一步比較ACE2蛋白在腎小球區(qū)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，IgA腎病組中局灶增生患者、合并MN患者、新月體患者均顯著高于對(duì)照組患者(P<0.05)，新月體患者顯著高于局灶增生患者、合并MN患者(P<0.05)。提示ACE2在IgA腎病患者腎小球區(qū)的表達(dá)高于對(duì)照組患者，但隨著疾病的進(jìn)展，ACE2在腎小球區(qū)的表達(dá)量逐漸升高。見圖3及圖5。

注：A、a為對(duì)照組，B、b為局灶增生，C、c為IgA腎病合并MN，D、d為新月體，其中a～d為腎小管區(qū)，A～B為腎小球區(qū)。

圖2 IgA腎病組和對(duì)照組腎穿刺組織中PRCP蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)
Fig.2 Protein expression in renal puncture tissue of IgA nephropathy group PRCP control group (immunohistochemistry,×400)

注：A、a為對(duì)照組，B、b為局灶增生，C、c為IgA腎病合并MN，D、d為新月體，其中a～d為腎小管區(qū)，A～B為腎小球區(qū)。

圖3 IgA腎病組和對(duì)照組腎穿刺組織中ACE2蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400)
Fig.3 Expression of ACE2 protein in renal puncture tissue of IgA nephropathy group and control group (immunohistochemistry,×400)

注：(1)與MCD組比較，P<0.05；(2)與局灶增生組比較，P<0.05。

圖4 對(duì)照組和各IgA腎病組患者腎穿刺組織中PRCP蛋白表達(dá)IOD值及腎小球評(píng)分比較
Fig.4 Comparison ofIODvalues glomerular score of PRCP protein expression in renal puncture tissues of control group and nephrotic group

注：(1)與MCD組比較，P<0.05；(2)與局灶增生組比較，P<0.05。

圖5 對(duì)照組和各IgA腎病組患者腎穿刺組織中ACE2蛋白表達(dá)IOD值及腎小球評(píng)分比較
Fig.5 Comparison ofIODvalues glomerular score of ACE2 protein expression in renal puncture tissues of control group and nephrotic group

2.4 IgA腎病患者組織中PRCP、ACE2的表達(dá)與IgA在腎小球中沉積的相關(guān)性

Superman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PRCP在腎小球區(qū)的表達(dá)與IgA在腎小球中的沉積呈負(fù)相關(guān)(r=-0.301，P=0.0027)，ACE2在腎小球區(qū)的表達(dá)與IgA在腎小球中的沉積呈正相關(guān)(r=0.306，P=0.024)。

3 討論

IgA腎病是世界范圍內(nèi)最普遍的原發(fā)性腎小球疾病，尤其以亞洲地區(qū)人群發(fā)病率最高[11]，任何年齡均可發(fā)病，以兒童和青少年最為常見[12]。目前對(duì)于IgA N的發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不明確，主要認(rèn)為與異常糖基化的IgA的產(chǎn)生有關(guān)[13]，腎穿刺活檢免疫熒光檢測可見IgA為主的免疫球蛋白及補(bǔ)體成分在腎小球系膜區(qū)沉積。明確其發(fā)病機(jī)制對(duì)指導(dǎo)疾病臨床治療、改善預(yù)后是至關(guān)重要的。

RAS系統(tǒng)是人類調(diào)節(jié)血壓和液體平衡最重要的激素系統(tǒng)之一，臨床上通過各類藥物中斷或影響這個(gè)系統(tǒng)中的不同反應(yīng)階段從而達(dá)到控制血壓，改善心力衰竭，改善腎功能衰竭等目的[14]。目前研究認(rèn)為在腎臟組織中存在與循環(huán)RAS系統(tǒng)互相關(guān)聯(lián)并相對(duì)獨(dú)立的局部RAS系統(tǒng)[15]。有研究報(bào)道，可能與IgA腎病和/或腎臟疾病高度相關(guān)的蛋白有PRCP[16]。PRCP作為RAS系統(tǒng)與激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)重要的連接點(diǎn)，在一些報(bào)道中發(fā)現(xiàn)在炎癥相關(guān)的腎臟疾病的發(fā)展的各個(gè)連續(xù)階段有血漿PRCP水平的升高[17]。另外在大量糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的研究中發(fā)現(xiàn)ACE2可通過影響組織微循環(huán)進(jìn)而對(duì)糖代謝以及腎組織病變產(chǎn)生作用，也可通過改變機(jī)體氧化應(yīng)激水平、影響腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等參與DN的病變過程[18]，并逐漸開始作為DN診斷和治療的新靶點(diǎn)[19]，但在IgA腎病的領(lǐng)域研究較少[20]。

本研究采用免疫組化的方法針對(duì)PRCP、ACE2的研究顯示，PRCP、ACE2在IgA腎病患者的腎組織中高表達(dá)，在對(duì)照組的MCD患者腎臟組織中少量表達(dá)，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，主要定位在腎小管上皮細(xì)胞上，以胞質(zhì)和胞膜為主，棕黃色呈彌散性分布，另外在腎小球系膜系膜、壁層上皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞也有表達(dá)，以胞膜為主，棕黃色呈線性或顆粒性分布，但在腎間質(zhì)血管及各類炎癥細(xì)胞中未見明顯表達(dá)。通過對(duì)IgA腎病不同病理表現(xiàn)分組的組間統(tǒng)計(jì)分析可見，隨著疾病的進(jìn)展，PRCP與ACE2在腎小球區(qū)域和腎小管區(qū)域的表達(dá)呈現(xiàn)出不同的發(fā)展趨勢(shì)，PRCP及ACE2在腎小球區(qū)的表達(dá)量隨疾病發(fā)展逐漸升高，尤其在形成新月體的腎小球中增生的壁層上皮細(xì)胞高表達(dá)，而在腎小管區(qū)的表達(dá)量隨疾病發(fā)展逐漸下降，推測腎間質(zhì)纖維化，腎小管上皮萎縮，其分泌的蛋白量減少。Superman相關(guān)分析結(jié)果顯示，PRCP在腎小球區(qū)的表達(dá)與IgA在腎小球中的沉積呈負(fù)相關(guān)(r=-0.301，P=0.0027)，ACE2在腎小球區(qū)的表達(dá)與IgA在腎小球中的沉積呈正相關(guān)(r=0.306，P=0.024)。異常糖基化的IgA現(xiàn)階段被認(rèn)為是IgA腎病的主要發(fā)病機(jī)制[21]，ACE2的表達(dá)與其沉積量相關(guān)，ACE2也很可能在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

綜上所述，在IgA腎病的進(jìn)展過程中，伴隨著PRCP、ACE2分泌量的變化，RAS系統(tǒng)可能在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起到一定作用，但其具體作用機(jī)制還不十分清楚，還需進(jìn)一步研究。對(duì)于PRCP、ACE2等RAS系統(tǒng)相關(guān)蛋白的檢測，對(duì)于判斷腎病的預(yù)后有一定幫助。