阿立塞替通過靶向Aurora激酶A提高人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性*

李舜， 楊智松， 韓國征， 李紅艷， 齊浩明

(1.大慶龍南醫(yī)院， 黑龍江 大慶市 163000； 2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 中醫(yī)二科,新疆 石河子 832008； 3.渭南市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 陜西 渭南 714000)

肺癌是致死率非常高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%～85%[1]。近年來，NSCLC的治療多采用手術(shù)、放療、化療、靶向治療等方法，其中放療及靶向治療已成為近期的研究熱點(diǎn)[2-4]。由于長時間放療會使癌癥細(xì)胞產(chǎn)生放射抵抗，故尋找提高癌細(xì)胞放射敏感性的靶點(diǎn)非常必要。Aurora激酶A可通過調(diào)節(jié)復(fù)制中心體、形成雙極紡錘體，對有絲分裂紡錘體上的染色體排列及有絲分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。研究表明，Aurora激酶A是成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和高級膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)[5-8]，還認(rèn)為Aurora激酶A涉許多類型的癌癥(乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、肝癌及胰腺癌)[9-14]。最新研究結(jié)果表明，SMARCB1基因可通過抑制Aurora激酶A的表達(dá)而達(dá)到抑制非中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)橫紋肌樣瘤細(xì)胞生長的作用[15]。阿立塞替(Alisertib, MLN8237)是一種有效的市場化的選擇性Aurora A抑制劑，對腫瘤有一定的抑制作用，是效果良好的放射增敏劑，本研究旨在探討阿立塞替對NSCLC放射敏感性的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

肺癌細(xì)胞NCI-H1975購自美國菌種保藏中心，MLN8237購自美國阿拉丁工業(yè)公司， RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國賽默飛世爾科技公司，胎牛血清購自美國賽默飛世爾科技公司，陰性siRNA、si Aurora Kinase A及siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染劑購自美國愛普拜斯公司，F(xiàn)AM-siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國碧迪公司，RT-PCR試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司，BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，qTR-PCR實(shí)驗(yàn)試劑盒美國賽默飛世爾科技公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司，6 MV X 線直線加速器購自德國西門子公司(劑量率為0.5 Gy/min)，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司)，酶標(biāo)儀購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)肺癌細(xì)胞NCI-H1975，3～4 d傳代1次，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RNAi載體的轉(zhuǎn)染 將靶向Aurora激酶A mRNA的siRNA和非靶向siRNA以及熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)以每6孔板5 nmol/L siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染劑為載體，按照逆轉(zhuǎn)染方案轉(zhuǎn)染到部分肺癌NCI-H1975細(xì)胞系中，并分組為：單純對照組(Control)、陰性對照組(Si control)及靶向Aurora激酶A組(si Aurora Kinase A)。

1.2.3CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 將siRNA轉(zhuǎn)染的、及未轉(zhuǎn)染肺癌NCI-H1975細(xì)胞分別(5 000個細(xì)胞/孔)接種在96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。對于用siRNA轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染72 h后，吸去培養(yǎng)基，加入10 μL CCK-8溶液，再孵育2 h，并分為Control 組、Si control 組和Si Aurora Kinase A組；對于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，以排槍向各孔中加入不同濃度(低濃度40 nmol/L、高濃度160 nmol/L)的MLN 8237[16]，并分為Control(DMSO)組，40 nmol/L組和160 nmol/L組；在作用24 h后，加入10 μL CCK-8溶液，并再孵育2 h。而后同樣用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(OD值)，按照以下公式計算細(xì)胞活力(以細(xì)胞活力反映細(xì)胞抑制率)：細(xì)胞活力=[OD值(加藥)-OD值(空白)]/[OD值(未加藥)-OD值(空白)×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將以siRNA轉(zhuǎn)染、及未轉(zhuǎn)染肺癌NCI-H1975細(xì)胞分別(5 000個細(xì)胞/孔)接種在96孔板中，收集用siRNA轉(zhuǎn)染72 h、及未轉(zhuǎn)染的NCI-H1975細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h，并在未轉(zhuǎn)染的組中加入不同濃度的MLN 8237(40 nmol/L及160 nmol/L)再次作用24 h，而后分別收集各組細(xì)胞于離心管內(nèi)，以1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌并離心2次；用Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞、Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色溶液混勻后在避光條件下室溫中反應(yīng)15 min；用流式細(xì)胞儀檢測、分析各組細(xì)胞凋亡率，分組同1.2.3。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的肺癌NCI-H1975細(xì)胞按照射劑量不同接種于含3 mL培養(yǎng)基中(皿的直徑為60 mm，按照照射劑量由低到高接種細(xì)胞數(shù)為200、400、800、1 200及1 600個/孔)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6 h待其貼壁；細(xì)胞貼壁后按照不同濃度進(jìn)行給藥，并分為Control(DMSO)組、40 nmol/L MLN 8237組及160 nmol/L MLN 8237組，每組設(shè)3個復(fù)孔；藥物作用24 h后，以每皿DMEM 3 mL高糖培養(yǎng)基換液，將細(xì)胞分別以 0、2、4、6、8 Gy的劑量進(jìn)行X射線照射；然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，并在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)；7 d后，用甲醇固定細(xì)胞，干燥后結(jié)晶紫染色10 min，清水緩緩沖去染液、干燥。以肉眼計數(shù)克隆數(shù)：含50個以上的細(xì)胞團(tuán)計數(shù)為1個克隆，計算克隆形成率、出種率( plating efficiency，PE) ，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)，按單擊多靶模型SF=1-(1-e^(-D/D0))n擬合繪制細(xì)胞存活曲線，并計算其平均致死劑量(Do)，準(zhǔn)閥計量值(Dq)，輻射值在2 Gy時單擊多靶模型擬合函數(shù)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)值(SF2)及輻射增敏比(SER)。

1.2.6qRT-PCR實(shí)驗(yàn) (1)Aurora Kinase A 引物：上游序列為TGATCCTTAGAGCAGCTTCG，下游序列為CTAGGGTTACTTGGAATGAT。(2) p21引物：上游序列為TAGTTCATCGAGTCGCTTT，下游序列為CACTCTGTTGCCACCTATCG。(3)p16引物：上游序列為CGAGCTAACAAGCAAGCAGC，下游序列為ACGTCACCGGATCCTCCAGAAC。(4)GAPDH 引物：上游序列為GTCTGCTCTGACTTCAACAGAG，下游序列為ACCAACCTGTCGCTGTAGCAAA。qRT-PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：上游引物(F)1μL、下游引物(R)1 μL，2×TaqMan? qPCR Greenmololaster Mix 10 μL, cDNA模板200 ng，nuclease free water 20 μL。GAPDH為內(nèi)源對照。qRT-PCR程序：95 ℃、3 min， 95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，40個循環(huán)；65 ℃上升至95 ℃。最后使用ΔΔCt方法計算基因表達(dá)相對量。

1.2.7熒光素酶分析實(shí)驗(yàn) 使用Cignal Finder 10 Pathway Reporter Arrays(SA Biosciences)進(jìn)行Pathway分析。將肺癌NCI-H1975細(xì)胞接種在添加了熒光素酶激動劑的96孔板中， 12 h后，用不同濃度(低濃度40 nmol/L、高濃度160 nmol/L)MLN 8237及照射(6 Gy)處理細(xì)胞，而后將細(xì)胞再培養(yǎng)24 h。使用雙熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega)在Glomax多光度計(Promega)測量熒光素酶活性，將熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性、并計算比率。用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NCI-H1975細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及敲減效率

將熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)轉(zhuǎn)染到NCI-H1975細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染效率達(dá)89.91%，表明以siPORT NeoFX轉(zhuǎn)染劑作為載體能滿足實(shí)驗(yàn)要求，如圖1。檢測NCI-H1975細(xì)胞中Aurora Kinase A 的表達(dá)量并計算敲減效率，如圖2所示，Si Aurora Kinase A組Aurora Kinase A的表達(dá)量為32.68%，與對照組及Si Control組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 抑制Aurora激酶A及加入MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞生長影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Si Control組的細(xì)胞生長率為(86.34±2.83)%，Si Aurora Kinase A組細(xì)胞生長率為(72.13±2.95)%，抑制Aurora激酶A可明顯抑制NCI-H1975細(xì)胞的生長(P=0.001 4)；與對照組比較，加入40 nmol/L MLN8237組的NCI-H1975細(xì)胞生長率(78.52±2.36)%明顯降低，P=0.000 4；加入160 nmol/L MLN8237組的NCI-H1975細(xì)胞生長率(51.37±3.12)%也顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)，提示MLN8237對NCI-H1975細(xì)胞有抑制作用，且隨濃度的增大，其抑制率增高。見圖3。

光鏡下明場熒光顯微鏡下暗場

圖1 NCI-H1975細(xì)胞FAM-siRNA的轉(zhuǎn)染效率(200×)
Fig.1 Transfection efficiency of FAM-siRNA on NCI-H1975 cells(200×)

注：(1)與Control組和Si Control組比較，P<0.01。

圖2 3組NCI-H1975細(xì)胞中Aurora Kinase A的表達(dá)量
Fig.2 Expression of Aurora Kinase A in the 3 groups

2.3 抑制Aurora激酶A及加入MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響

通過Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NCI-H1975細(xì)胞在經(jīng)不同處理之后的凋亡水平，如圖4、5所示，Aurora激酶A被抑制后A3組的細(xì)胞凋亡率為(31.52±1.51)%，與A2組細(xì)胞凋亡率(1.35±0.43)%比較，細(xì)胞凋亡水平提高(P<0.001)。 40 nmol/L MLN8237的B2組細(xì)胞凋亡率為(39.52±1.51)%，160 nmol/L MLN8237的B3組細(xì)胞凋亡率為(82.67±2.64)%，加入MLN8237的B2、B3組細(xì)胞凋亡率明顯高于單純對照組B1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為抑制Aurora激酶A對 NCI-H1975細(xì)胞生長的影響，(1)與Si Control組比較P<0.01；B為加入不同濃度MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞生長的影響，(1)與Control組比較，P<0.001。

圖3 抑制Aurora激酶A及加入MLN8237對NCI-H1975細(xì)胞生長的影響
Fig.3GrowthofNCI-H1975cellseffectedbyinhibitingofAurorakinaseAandaddingwithMLN8237

注：A1為Control組，A2為Si Control組，A3為Si Aurora Kinase A組，B1為Control組，B2為40 nmol/L MLN8237組，B3為160 nmol/L MLN8237組。

圖4 不同組別NCI-H1975細(xì)胞凋亡水平
Fig.4 Representative diagram about the apoptosis of NCI-H1975 cells in the different groups

注： A為抑制Aurora激酶A后對NCI-H1975細(xì)胞凋亡影響的統(tǒng)計圖，(1)與Si Control組比較，P<0.001；B為加入MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞凋亡影響的統(tǒng)計圖，(1)與Control組比較，P<0.001。

圖5 抑制Aurora激酶A及加入MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響
Fig.5 Apoptosis of NCI-H1975 cells effected by inhibiting Aurora kinase A and adding with MLN8237

2.4 MLN8237對 NCI-H1975細(xì)胞放射敏感性的影響

通過克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察MLN8237對NCI-H1975細(xì)胞放射敏感性的影響，結(jié)果顯示MLN8237可明顯提高NCI-H1975細(xì)胞的放射敏感性。將各組SF值通過單擊多靶模型進(jìn)行擬合：SF=1-(1-e^(-D/D0)^n，得出圖6所示曲線，發(fā)現(xiàn)加入MLN8237能夠顯著降低照射后NCI-H1975細(xì)胞的克隆形成能力，對NCI-H1975細(xì)胞具有明顯的放射增敏作用，且隨劑量增大其增敏效果越顯著，見表1。

注:對照組與40 nmol/L MLN8237組比較，P<0.001；對照組與160 nmol/L MLN8237組比較，P<0.001。

圖6 MLN8237對NCI-H1975細(xì)胞照射后克隆形成能力影響
Fig.6 Effect of MLN8237 on the cloning ability of NCI-H1975 cells after irradiation

表1 NCI-H1975細(xì)胞IR后多靶單擊數(shù)學(xué)模型擬合細(xì)胞存活曲線參數(shù)Tab.1 NCI-H1975 cell Irradiated multi-target click mathematical model fit with cell survival curve parameters

2.5 抑制Aurora激酶A對照射(6Gy)后NCI-H1975細(xì)胞p21及p16表達(dá)的影響

通過qRT-PCR評估NCI-H1975細(xì)胞中p16及p21的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，加入MLN8237(Aurora激酶A抑制劑)照射后，p16及p21的表達(dá)明顯上調(diào)，并且藥物濃度越高，上調(diào)越明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見圖7。

注：(1)與IR組比較，P<0.001。

圖7 抑制Aurora激酶A對照射后NCI-H1975細(xì)胞p16及p21表達(dá)的影響
Fig.7 Expression of p16 and p21 in NCI-H1975 cells effected by inhibiting Aurora kinase A after IR

2.6 抑制Aurora激酶A對照射(6Gy)后NCI-H1975細(xì)胞E2F及JNK活性的影響

如圖8所示，通過雙熒光素酶測定系統(tǒng)測量熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)，加入MLN8237(Aurora激酶A抑制劑)照射后顯著降低了E2F的活性(P<0.001)；然而JNK的活性顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制蛋白激酶可以抑制癌細(xì)胞的生長并且可以增強(qiáng)輻射[16]。Aurora激酶A家族其中維持正確的染色體分離的Aurora激酶A與許多不同的癌癥有關(guān)[17]。本研究在前言中已提到，Aurora激酶A是成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的不良標(biāo)志物[5, 8]。近期也有研究報道，Aurora激酶A是SMARCB1在腎臟和肌肉橫紋肌樣瘤的直接靶標(biāo)，并進(jìn)一步闡明了抑制Aurora激酶A在治療橫紋肌樣瘤時的關(guān)鍵作用[15]。該研究的數(shù)據(jù)也為Aurora激酶A靶向治療NSCLC提供了強(qiáng)有力的生物學(xué)依據(jù)，并為Aurora激酶A抑制劑的臨床試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。而在本研究中證明了Aurora激酶A是治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。CCK8及凋亡實(shí)驗(yàn)顯示抑制Aurora激酶A能抑制NCI-H1975細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)該細(xì)胞的凋亡；克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示加入Aurora激酶A的抑制劑MLN8237能有效提高NCI-H1975細(xì)胞的放射敏感性。放療在NSCLC治療過程中起重要作用，但由于輻射劑量通常受正常組織毒性的限制，添加一定的放射增敏劑加強(qiáng)放療效果，降低放療的副作用具有重要意義[18]。本研究的數(shù)據(jù)表明添加Aurora激酶A的抑制劑MLN8237與放療聯(lián)合治療NSCLC，其放射增敏效果良好，在未來的臨床實(shí)驗(yàn)中本研究也將對此加以探索。

注：(1)與IR組比較，P<0.01。

圖8 抑制Aurora激酶A調(diào)節(jié)照射后E2F及JNK的熒光素酶活性
Fig.8 Activity of E2F and JNK in NCI-H1975 cells adjusted by inhibiting Aurora kinase A after IR

最近的研究已發(fā)現(xiàn)了一系列的Aurora激酶A的抑制劑，例如ZM447439(AstraZeneca，Boston，MA)和VX-680(Merck，Rahway，NJ)，都能顯著抑制Aurora激酶A和B[19-20]。另外一些研究中的MLN8237已被證明對Aurora激酶A有顯著的選擇性，抑制效果更明顯[21]。同時本研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)也表明了MLN 8237是一種很有前景的NSCLC治療小分子抑制劑，是一種效果明顯的放射增敏劑，可用于建立對NSCLC治療的臨床實(shí)驗(yàn)。另有相關(guān)研究指出，抑制Aurora激酶A可增強(qiáng)非典型畸胎瘤樣橫紋肌瘤細(xì)胞的放射敏感性[15]。對于MLN 8237抑制Aurora激酶A而提高NSCLC放射敏感性的機(jī)制，本研究也做了一些相關(guān)研究。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)本研究評估了NCI-H1975細(xì)胞中p16及p21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Aurora激酶A被抑制后，p16及p21的表達(dá)明顯上升，從而阻斷了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)CDK4-6對RB蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制了細(xì)胞周期，降低了NCI-H1975細(xì)胞的增殖[22]；通過熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)本研究發(fā)現(xiàn)，抑制Aurora激酶A顯著降低了E2F的活性，但JNK的活性顯著提高，這激活了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)了促凋亡信號傳導(dǎo)機(jī)制，促進(jìn)了NCI-H1975細(xì)胞的凋亡[23]。

綜上所述，阿立塞替能通過靶向Aurora激酶A，抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，從而提高NCI-H1975細(xì)胞的放射敏感性。然而，由于放射增敏靶向藥物的分子機(jī)制十分復(fù)雜，而本研究只是部分對其進(jìn)行了探索，其放射敏感性的臨床潛力及具體分子機(jī)制在將來仍需進(jìn)一步完善。

(2020-03-03收稿，2020-05-11修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 冉海勇