心血管發(fā)育相關(guān)基因mpx在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)*

向文碧， 周棟珍， 李志操， 周艷華， 張鵬， 崔冬冰， 何志旭， 舒莉萍**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室， 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心, 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 5.貴州省貴陽(yáng)市婦幼保健院 貴陽(yáng)市兒童醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng) 550003； 6.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000)

髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase， MPO) 是髓系細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，主要由中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞分泌[1-2]。隨著對(duì)MPO的深入研究，發(fā)現(xiàn)MPO涉及多種疾病進(jìn)程。既往國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，MPO與心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發(fā)生有關(guān)[3-4]，髓樣特異性過(guò)氧化物酶mpx基因是斑馬魚中最接近哺乳動(dòng)物MPO基因的同源物[5]。基于斑馬魚胚胎通體透明、體外受精、發(fā)育迅速等優(yōu)勢(shì)，本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，旨在探討斑馬魚mpx在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)，為進(jìn)一步探索mpx與CVD的關(guān)系及開(kāi)發(fā)治療CVD的新藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型斑馬魚由本課題組實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)：28 ℃循環(huán)水中養(yǎng)殖，幼魚和成魚分別以草履蟲和豐年蝦喂養(yǎng)，光照12 h/d，收集受精后0.75 h、3.7 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、72 h(hours post-fertilization, hpf)共11個(gè)時(shí)相的胚胎，用于提取總RNA和原位雜交。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XhoⅠ、DNA Marker、Trizol、First Strand cDNA Synthesis Kit試劑均購(gòu)自Thermo公司，KOD-Plus PCR酶購(gòu)自Toyobo公司，T3聚合酶購(gòu)自Promega公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司，地高辛RNA和NucAwayTMSpin Columns均購(gòu)自Ambion公司，BCIP/NBT試劑盒購(gòu)自VECTORLab公司，Proteinase K購(gòu)自Sigma公司，酵母提取物和氨卞青霉素均購(gòu)自素索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1斑馬魚總RNA提取及cDNA的合成 收集0.75 h、3.7 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、48 h、72 hpf共11個(gè)時(shí)相的斑馬魚胚胎，每個(gè)時(shí)相25枚置于1.5 mL的Ep管中，按Trizol法提取總RNA，然后用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒按說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mpx基因片段克隆 用NCBI查詢mpx基因的全長(zhǎng)cDNA，根據(jù)mpx全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)mpx基因引物序列，mpx-R:5′-CCCAAGCTTCCTCAACGACAGCACTCTGA-3′，mpx-F: 5′-TCGCTCGAGTACTC

CAGGTAGGGTTGAGCA-3′，該引物含有Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min，(94 ℃ 15 s、61 ℃ 30 s、68 ℃ 1 min)36次循環(huán)，68 ℃ 10 min。將擴(kuò)增的目的條帶割膠回收。

1.2.3pCS2+-mpx探針質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 用Hind Ⅲ和XhoⅠ酶將PCR擴(kuò)增的mpx產(chǎn)物和載體pCS2+進(jìn)行雙酶切，電泳分析雙酶切產(chǎn)物并割膠回收。將酶切后的mpx基因PCR產(chǎn)物和載體pCS2+用T4連接酶進(jìn)行連接、連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)AMP抗性進(jìn)行篩選，長(zhǎng)菌后挑單克隆用于菌落mpx基因RT-PCR鑒定，并通過(guò)試劑盒抽提pCS2+-mpx探針質(zhì)粒；再將獲得的pCS2+-mpx探針質(zhì)粒用HindIII和XhoI酶進(jìn)行雙酶切鑒定，且送諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.4地高辛標(biāo)記的mpx基因反義mRNA的制備 用Hind ⅢI將pCS2+-mpx質(zhì)粒酶切線性化并回收，再以線性化的pCS2+-mpx質(zhì)粒為模板，加入地高辛標(biāo)記的寡核苷酸用T3聚合酶合成mpx探針并回收，電泳鑒定后保存在-70 ℃。

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交(whole mount in situ hybridization，WISH) 洗滌和脫水：將不同時(shí)相的胚胎從4 ℃冰箱取出并用1×PBST進(jìn)行洗滌，再用1×PBST配置的不同濃度的甲醇將胚胎進(jìn)行梯度脫水處理。預(yù)雜交：加入1 mL預(yù)雜交液于68 ℃預(yù)雜交15 min，去掉預(yù)雜交液，加入0.3 mL雜交液于68 ℃預(yù)雜交1 h。雜交：加入300 ng探針于68 ℃雜交過(guò)夜。洗滌：去掉雜交液后用不同濃度SSCT進(jìn)行洗滌。封閉：用阻滯液封閉2 h。孵抗體：于阻滯液中加入為1 ∶5 000(體積比)地高辛抗體，于冷庫(kù)中4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌：用MABT進(jìn)行洗滌。染色：用BCIP/NBT染液室溫進(jìn)行染色約4 h，邊染色邊觀察并記錄。終止染色和拍照：染色完畢后，用1×PBST洗去染液終止染色，并用體視顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 mpx基因擴(kuò)增結(jié)果

mpx基因擴(kuò)增結(jié)果得到一條單一的位于100～200 bp的電泳條帶，大小跟設(shè)計(jì)的mpx目的片段173 bp相符(圖1)，說(shuō)明mpx基因片段擴(kuò)增成功。

注：M為DNA marker Ⅰ，1為mpx RT-PCR product，2為Blank control。

圖1mpx基因 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
Fig.1 Electrophoresis ofmpxgene amplified by RT-PCR

2.2 酶切鑒定結(jié)果

pCS2+-mpx雙酶切后得到兩個(gè)條帶，一條位于100～200 bp，這與目的片段mpx基因的173 bp大小是一致的；另外一條約4 016 bp，這與pCS2+載體Hind Ⅲ、XhoI雙酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果一致(圖2)。說(shuō)明pCS2+-mpx探針質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：M為DNA marker Ⅲ，1為pCS2+，2為pCS2+-mpx，3為mpx PCR product，4為Blank control。

圖2pCS2+-mpx重組質(zhì)粒HindⅢ、XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
Fig.2 Electrophoresis of digestion products ofpCS2+-mpxbyHindⅢ andXhoⅠ

2.3 pCS2+-mpx重組質(zhì)粒菌落RT-PCR鑒定結(jié)果

pCS2+-mpx重組質(zhì)粒經(jīng)菌落RT-PCR得到的條帶與設(shè)計(jì)的mpx目的片段一致(圖3)。

注：M為DNA marker Ⅰ，1為mpx RT-PCR product，2為Blank control。

圖3pCS2+-mpx重組質(zhì)粒菌落RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR product of bacterial colony for recombinant plasmidpCS2+-mpx

2.4 pCS2+-mpx重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

通過(guò)氨芐抗性篩選的pCS2+-mpx重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果如圖4，經(jīng)NCBI檢索對(duì)比發(fā)現(xiàn)與mpx基因一致。說(shuō)明pCS2+-mpx探針質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖4 pCS2+-mpx重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.4 Verification of sequence in recombinant plasmid pCS2+-mpx by sequencing

2.5 mpx基因的斑馬魚全胚胎原位雜交結(jié)果

結(jié)果顯示在18 hpf前的斑馬魚胚胎中無(wú)明顯陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)，在24 hpf，斑馬魚胚胎中間細(xì)胞團(tuán)有較弱的藍(lán)紫色陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)；從24 hpf開(kāi)始一直持續(xù)到72 hpf，在斑馬魚胚胎卵黃囊表面、心臟和軸向脈管系統(tǒng)中出現(xiàn)較強(qiáng)的的藍(lán)紫色陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)；尤其是在72 hpf，在整個(gè)胚胎頭部、卵黃囊表面、尾部中均有彌散的藍(lán)紫色陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)(圖5)。說(shuō)明mpx基因在斑馬魚胚胎18 hpf以后開(kāi)始表達(dá)，并且主要在心血管系統(tǒng)中高表達(dá)。

注：紅色箭頭所示心臟，藍(lán)色箭頭所示軸向脈管系統(tǒng)，黑色箭頭所示中間細(xì)胞團(tuán)。

圖5mpx基因的斑馬魚全胚原位雜交結(jié)果(40×)
Fig.5 Expression pattern ofmpxgene in zebrafish embryos at different periods after fertilization using whole-mount in situ hybridization (40×)

3 討論

MPO是血紅素過(guò)氧化物酶超家族的主要成員，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞[6]。人MPO是一種同源二聚體蛋白，其質(zhì)量大小為146 kDa，主要由兩個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同但功能相互獨(dú)立的73 kDa的蛋白質(zhì)所構(gòu)成。人類mpo基因位于17號(hào)染色體，由12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，大小約11 kb。MPO在血液中水平升高與炎癥和氧化應(yīng)激增加有關(guān)[7-8]，并且國(guó)內(nèi)外研究表明MPO與CVD (包括冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈高壓、肺動(dòng)脈高壓、心肌缺血再灌注相關(guān)損傷、中風(fēng)、心律失常和靜脈血栓形成等)之間存在聯(lián)系[9-13]，MPO升高可能意味著CVD的風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。斑馬魚相比于其它模式生物具有胚胎通體透明、體外受精、發(fā)育迅速等用于VCD研究和開(kāi)發(fā)心血管新藥的優(yōu)勢(shì)[15]，因此本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)展相關(guān)研究。

mpx基因是斑馬魚中最接近哺乳動(dòng)物MPO基因的同源物。成年斑馬魚體內(nèi)主要包括嗜異性粒細(xì)胞(即中性粒細(xì)胞)和較稀有的嗜酸性粒細(xì)胞這兩種粒細(xì)胞。mpx基因主要表達(dá)在斑馬魚的中性粒細(xì)胞，并且斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及功能活性與哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞類似[16]。因此，本研究主要探討斑馬魚mpx基因的具體表達(dá)模式，以期為進(jìn)一步探索mpx與CVD的關(guān)系和開(kāi)發(fā)治療CVD的新藥奠定基礎(chǔ)。本課題首先通過(guò)設(shè)計(jì)mpx基因引物成功擴(kuò)增出mpx基因片段，并通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建pCS2+-mpx重組質(zhì)粒，經(jīng)菌落mpx基因RT-PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定pCS2+-mpx質(zhì)粒構(gòu)建成功。然后，以pCS2+-mpx質(zhì)粒為模板用T3聚合酶成功制備了mpx反義RNA探針。最后，用全胚胎原位雜交技術(shù)檢測(cè)了斑馬魚mpx在胚胎發(fā)育中的具體表達(dá)情況。

原位雜交結(jié)果顯示，mpx基因在18 hpf前的斑馬魚胚胎中無(wú)明顯表達(dá)，提示mpx基因在斑馬魚胚胎中18 hpf前可能不表達(dá)或者表達(dá)量較少以致于用全胚胎原位雜交技術(shù)無(wú)法檢測(cè)出。在24 hpf，mpx基因在斑馬魚胚胎中間細(xì)胞團(tuán)中低表達(dá)，這與中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的位置一致[17]。斑馬魚心血管系統(tǒng)由靜脈竇、心房、心室和動(dòng)脈球等結(jié)構(gòu)組成，斑馬魚的心血管發(fā)育速度較快, 心肌在22 hpf即開(kāi)始收縮，24 hpf產(chǎn)生心跳，48 hpf心血管系統(tǒng)發(fā)育基本完成[18-19]。在22 hpf時(shí)，原始心管能夠產(chǎn)生有節(jié)奏的蠕動(dòng)波，在大約33 hpf原始心管心管發(fā)育成S形構(gòu)型并分化成心房和心室時(shí)，這些蠕動(dòng)波轉(zhuǎn)化為規(guī)律協(xié)調(diào)的收縮[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，mpx基因24～72 hpf在斑馬魚卵黃囊表面及心臟高表達(dá)，這與斑馬魚心臟發(fā)育的主要部位和時(shí)間相吻合，提示mpx基因可能參與調(diào)控斑馬魚心臟的發(fā)育。血管是所有器官功能和發(fā)育的基本組成部分，具有不同的大小和特殊的反應(yīng)性，這取決于它們的功能和它們所連接的器官[22]。斑馬魚血管發(fā)育始于內(nèi)皮祖細(xì)胞從中胚層遷移形成原始主動(dòng)脈和主要靜脈而形成簡(jiǎn)單的循環(huán)，在24 hpf后，建立主要的軸向血管[23-24]。到72 hpf時(shí)，主要的軸向血管通過(guò)背腹對(duì)齊的節(jié)間動(dòng)脈和節(jié)間靜脈相連，隨后產(chǎn)生兩個(gè)單獨(dú)的背側(cè)縱向吻合血管以連接軀干每側(cè)的節(jié)間血管[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，從24 hpf開(kāi)始斑馬魚mpx基因在卵黃囊表面和軸向脈管系統(tǒng)中高表達(dá)，一直持續(xù)到72 hpf，這與斑馬魚早期胚胎血管發(fā)育的時(shí)間和部位一致，尤其是在72 hpf，mpx基因在整個(gè)斑馬魚胚胎頭部、卵黃囊表面、尾部中彌散表達(dá)，這與血管是所有器官和組織的基本組成部分的特點(diǎn)相吻合，提示mpx基因可能與斑馬魚血管的發(fā)育相關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建pCS2+-mpx質(zhì)粒制備mpx反義RNA探針，并以mpx反義RNA探針進(jìn)行全胚胎原位雜交技術(shù)證實(shí)，mpx基因在斑馬魚的心血管系統(tǒng)發(fā)育的時(shí)間和部位中都有表達(dá)，提示mpx基因可能參與調(diào)控斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。