趨化因子受體5 Δ32 突變在中國20個民族群體中的分布*

陶玉芬， 史磊， 姚宇峰， 史荔， 劉舒媛

(中國醫(yī)學科學院 & 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所， 云南 昆明 650118)

趨化因子受體5(chemokine receptor 5,CCR5)是一種G蛋白偶聯(lián)受體[1]，CCR5主要表達于巨噬細胞、單核細胞、記憶性T細胞和樹突狀細胞表面，其在病原感染后調(diào)節(jié)免疫細胞的激活和遷移中起到了重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，CCR5是人和猴免疫缺陷病毒(human and simian immunodeficiency virus,HIV and SIV)的主要輔助性受體之一，CCR5基因位于人染色體3q21.3。迄今為止，在CCR5基因上發(fā)現(xiàn)了大約96種突變[3]，其中以CCR5Δ32突變的研究最為廣泛。CCR5Δ32(即rs333)是指CCR5基因編碼區(qū)第185位氨基酸密碼子之后(554nt-585nt)發(fā)生了32個堿基的缺失，導致開放讀碼框(open reading frame, ORF)錯位，造成了翻譯的提前終止，在細胞膜表面產(chǎn)生截短的、無功能的穿膜蛋白，從而使的HIV-1的包膜蛋白gp-120不能與CCR5有效結(jié)合，從而阻止了HIV-1進入細胞[4]。攜帶CCR5Δ32突變純合子的個體對HIV-1感染有明顯的抵抗性，攜帶CCR5Δ32雜合子個體也表現(xiàn)出明顯的獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)進程減慢[5]。有研究報道，通過移植攜帶CCR5Δ32突變純合子的造血干細胞后，先后有2例AIDS患者體內(nèi)的HIV病毒清除[6]，另外也有使用CCR5拮抗劑如Maraviroc對AIDS進行治療的方案，可見，CCR5已成為治療AIDS研究的最佳靶點之一。在全世界范圍內(nèi)CCR5Δ32突變的分布具有明顯的地理特征，不同群體中的分布頻率差異很大：在非洲、美洲印第安人、東亞人及南亞人中頻率極低或者缺乏，歐洲人群CCR5Δ32突變的平均頻率為10%，呈現(xiàn)出由北到南逐漸降低的趨勢[7]。本文旨在觀察CCR5Δ32突變在中國20個不同民族群體中的分布情況，了解CCR5Δ32突變在中國人群中的擴散特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象

根據(jù)“知情同意”的原則，納入中國20個不同民族群體，共計2 788例健康無關(guān)個體作為研究對象(表1)，所有研究對象自述3代之內(nèi)均來自同一民族群體，年齡30～75歲。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 采集研究對象外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，用AxyPrep血基因DNA組試劑盒(Axygen，中國)提取基因組DNA，并用超微量紫外分光光度計(ND-2000，美國ThermoFisher公司)檢測DNA的濃度和純度。

1.2.2CCR5Δ32等位基因檢測 參考文獻設(shè)計CCR5Δ32等位基因的擴增引物：正向引物為5′-CTCGGATCCACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCT-3′，反向引物為5′-CTCGTCGACATGATGTGTAAGATAAGCCTCAC-3′(引物由Invitrogen公司合成)。10 μL PCR擴增反應(yīng)體系包含2×PrimeSTAR MAX Premix (TaKaRa，大連) 1 μL、20 ng基因組DNA及每條引物10 pmol/L。PCR擴增條件：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s、55 ℃退火5 s、72 ℃延伸5 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)成像并分析結(jié)果。根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小和NCBI中報道的CCR5基因的序列，檢測個體的基因型判定：野生型純合子(rs333 wt/wt)為一條242 bp的片段、突變型純合子(rs333 mt/mt)為一條210 bp的片段、雜合子(rs333 wt/mt)包括242 bp和210 bp的2條片段。對研究對象的CCR5Δ32(rs333-mt)等位基因進行計數(shù)，并計算各群體CCR5Δ32突變的頻率。

1.2.3CCR5Δ32等位基因的測序驗證 PCR產(chǎn)物分別使用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen，德國)PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒對CCR5Δ32等位基因的PCR產(chǎn)物進行純化回收，并以PCR引物(F: 5′-CTCGGATCCACCAGATCTCAAAAAGAAG

GTCT-3′)作為測序引物，使用BigDye V3.1(ABI，美國)測序試劑盒進行測序反應(yīng)，并在ABI3730測序儀上進行序列測定。測序結(jié)果用DNAstar軟件的Clustal W模塊進行序列比對，參考序列為GRCh38.p12(NC_000003.12)。

2 結(jié)果

2.1 CCR5 Δ32等位基因的PCR產(chǎn)物電泳

2.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(見圖1)，野生型純合子(rs333 wt/wt)為一條242 bp的片段、雜合子(rs333 wt/mt)為242 bp和210 bp的2條片段，本研究中未檢測到突變純合子(rs333 mt/mt)。

2.2 CCR5 Δ32等位基因的測序驗證

分別將等位基因rs333-wt和rs333-mt進行測序驗證(見圖2)，測序結(jié)果用DNAstar軟件的Clustal W模塊進行序列比對，發(fā)現(xiàn)rs333-mt等位基因與rs333-wt等位基因相比缺失了32個核苷酸，缺失序列為GTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACA。

注：DL2000為DNA分子標記，第6泳道為雜合子(rs333 wt/mt)，其余泳道為野生型純合子(rs333 wt/wt)的PCR擴增產(chǎn)物。

圖1CCR5Δ32等位基因的PCR產(chǎn)物進行2.5%瓊脂糖電泳結(jié)果
Fig.1 Results of 2.5% agarose gel electrophoresis on PCR products ofCCR5Δ32 alleles

注：rs333wt為野生型等位基因，rs333 mt為突變等位基因。

圖2CCR5Δ32(rs333)等位基因測序結(jié)果
Fig.2 Sequencing results ofCCR5Δ32 (rs333) allele

2.3 中國20個不同民族CCR5Δ32基因突變

檢測中國20個不同民族共計2 788個健康個體的CCR5Δ32基因突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鄂溫克族檢測到1例CCR5Δ32基因突變雜合子(rs333 wt/mt)，CCR5Δ32突變頻率為1.25%；回族(寧夏)檢測到1例CCR5Δ32基因突變雜合子(rs333 wt/mt)，CCR5Δ32突變頻率為0.68%；塔吉克族檢測到1例CCR5Δ32基因突變雜合子(rs333 wt/mt)，CCR5Δ32突變頻率為1.11%；云南漢族人群中檢測到2例CCR5Δ32基因突變雜合子(rs333 wt/mt)，CCR5Δ32突變頻率為0.04%；其余群體中均未檢測到CCR5Δ32基因突變。見表1。

3 討論

CCR5是主要表達于巨噬細胞、單核細胞、記憶性T細胞和樹突狀細胞表面的一種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，與其結(jié)合的配體為人巨噬細胞炎性蛋白-1(macrophage inflammatory protein-1α and 1β, MIP-1α, MIP-1β)，調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌的細胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and secreted factor, RANTES)，單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1, MCP-2, MCP-3 and MCP-4)[8]，CCR5在病原感染后誘導炎性細胞活化、驅(qū)化、增殖和免疫調(diào)節(jié)中起到了重要的作用[2]。

本研究對中國20個不同民族群體的2 788例健康個體進行了CCR5Δ32突變檢測，觀察CCR5Δ32突變在中國不同地區(qū)人群中的分布情況，有助于了解該基因位點在中國人群中的分布擴散。結(jié)果顯示，在鄂溫克族CCR5Δ32突變頻率為1.25%、回族(寧夏)CCR5Δ32突變頻率為0.68%、塔吉克族

表1 2 788例研究群體及CCR5 Δ32突變情況Tab.1 2 788 study groups and CCR5 Δ32 mutations

CCR5Δ32突變頻率為1.11%、云南漢族CCR5Δ32突變頻率為0.04%，其余群體中CCR5Δ32突變頻率為0.00%。本研究結(jié)果與已報道的中國不同民族群體的CCR5Δ32突變頻率一致：喀什地區(qū)維吾爾族CCR5Δ32頻率為3.48 %[9]，新疆伊犁地區(qū)維吾爾族HIV感染高危人群為4.47%[10]，蒙古族為1.12 %[11]；而中國南方的民族群體CCR5Δ32突變頻率卻很低，德宏地區(qū)傣族和景頗族[12]、廣西壯族[13]、深圳漢族[9]等CCR5Δ32頻率均為0%，四川彝族為0.84%[14]。研究顯示，除人類外未發(fā)現(xiàn)其他非人靈長類動物存在CCR5Δ32突變[15]，這表明CCR5Δ32是進化過程中的新發(fā)突變。在全世界范圍內(nèi)CCR5Δ32突變的分布具有明顯的地理分布特征，在歐洲群體中，CCR5Δ32的頻率呈現(xiàn)出由北到南逐漸降低的趨勢：歐洲北部阿什肯納基猶太人(Ashkenazi Jews)的CCR5Δ32頻率高達20.93%[16]，另外，俄羅斯的Ugro-Finnic人群的CCR5Δ32頻率也很高(15%～18%)[17]，在歐洲中部的一些國家則頻率開始下降，西班牙北部人群頻率為8.16%、斯洛文尼亞為8.7%、克羅地亞為7.1%，而歐洲南部CCR5Δ32頻率相對較低(2%～5%)[17]。對亞洲人群的研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群CCR5Δ32的突變頻率很低，泰國人群[18]、印度北部人群[19]都未檢測到CCR5Δ32突變。在非洲、美洲印地安人中CCR5Δ32突變的頻率也極低或者缺乏[7]。關(guān)于CCR5Δ32突變的起源和蔓延最經(jīng)典的是維京假說認為CCR5 Δ32出現(xiàn)于公元1000-1200年前斯堪的納維亞，向北傳入冰島，向南傳入中歐和南歐，向東傳入俄羅斯。中國的漢族群體和南方地區(qū)的各民族的CCR5Δ32突變頻率很低，但北方的一些群體如維吾爾族等卻有相對高的CCR5Δ32突變頻率。前期對不同人群遺傳結(jié)構(gòu)的研究顯示，中國南北民族群體之間具有顯著的遺傳差異，新疆維吾爾族(阿爾泰語系，突厥語族)、塔吉克族(印歐語系，伊朗語族)等西北人群是由東亞人與遷徙而來的高加索人混合而成[20-21]，遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示維吾爾族人群有30%～55%的歐洲人遺傳成分[22]，鄂溫克族(阿爾泰語系、滿-通古斯語族)和回族(漢藏語系、漢語族)也是典型的北方群體，可能這些群體的CCR5Δ32突變是來源于歐洲，因此基因頻率由北向南逐漸降低。另外，對漢族人群HLA基因多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，云南漢族群體介于北方群體和南方之間，因此云南漢族群體遺傳結(jié)構(gòu)兼具了南北方的特征[23]。另外，關(guān)于CCR5Δ32突變的起源和頻率有選擇壓力假說認為，CCR5Δ32突變起源于約800年前，經(jīng)過一個很強的古老選擇壓力而被保留下來，這一選擇作用可能為黑死病(鼠疫)。在公元1346-1352年間，歐洲爆發(fā)了廣泛的黑死病，這場黑死病造成了歐洲2 500萬人死亡，這種選擇壓力導致了歐洲人的后裔中CCR5基因發(fā)生了遺傳漂變(歐洲人群CCR5Δ32突變平均頻率為10%)[7,24]。也有學者提出，天花病毒對人群也具有較強的選擇作用導致歐洲后裔CCR5Δ32突變頻率的升高。中國不同地區(qū)的人群除遺傳背景差異之外，南北方不同的病原選擇壓力也是造成南北方基因突變頻率差異的原因。

研究發(fā)現(xiàn)CCR5與多種病原體的感染與關(guān)聯(lián)，如HIV、痘病毒(poxvirus)[25]、流感病毒(influenza)[26]、巨細胞病毒(cytomegalovirus)[27]、單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV))[28]、西尼羅河病毒(Nile virus)[29]以及蜱媒腦炎病毒(tickborne encephalitis virus)[30]等。CCR5基因變異也與許多病原感染的易感性相關(guān)，如HIV感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染[31]、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、結(jié)核桿菌(tuberculosis)感染[32]等。其中CCR5在HIV感染及其在艾滋病進程中作用的研究最為廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，CCR5是HIV-1入侵集體細胞的主要輔助受體之一，CCR5的N-端和胞外結(jié)構(gòu)域2(extracellular loop domain, ECL2)在HIV-1感染時起著關(guān)鍵作用，N-端Tyr-3、Tyr-10、Tyr-14及Tyr-15四個酪氨酸殘基的硫酸化有助于CCR5與HIV包膜蛋白復(fù)合物gp120/CD4結(jié)合，ECL2是HIV-1包膜蛋白gp120與CCR5相互作用的關(guān)鍵區(qū)域[3, 33]。CCR5Δ32突變是CCR5第185位氨基酸之后(554nt-585nt)發(fā)生了32 bp堿基的缺失，具有CCR5Δ32純合性突變的基因在翻譯過程中會導致閱讀框錯位，從而導致在淋巴細胞膜表面產(chǎn)生截短的、無功能的CCR5跨膜蛋白，從而使HIV-1的gp-120不能與CCR5 Δ32有效結(jié)合，導致HIV-1病毒不能進入宿主細胞[7]。對于CCR5Δ32雜合子來說，雖然它無抵抗病毒感染的作用，但卻可以明顯推遲艾滋病的進程，原因可能是CCR5Δ32雜合子會減少CCR5在細胞表面的表達，從而減少進入體內(nèi)的病毒量，并在慢性感染早期，減少病毒復(fù)制，明顯減少HIV-1病毒RNA在血清或血漿中的含量[34]。近年研究發(fā)現(xiàn)，真核生物基因表達的調(diào)控的一個重要方面是通過無義介導的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途徑識別含有提前終止密碼子(premature translation termination codon,PTC)的異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并快速降解異常的mRNAs以防止有害的截短蛋白(truncated proteins)的產(chǎn)生。Ashton等[35]發(fā)現(xiàn)，人CCR5 mRNA序列第407位核苷酸之后存在一個程序化核糖體移碼(programmed -1 ribosomal frameshift, -1 PRF)信號序列，該-1 PRF可引導翻譯核糖體識別CCR5 mRNA上的PTC，進而啟動NMD途徑對異常CCR5 mRNA進行降解，從而降低CCR5的表達量；同時CCR5 mRNA序列上的-1PRF也可通過miRNA-1224降低CCR5的表達水平。由此推測，含有CCR5Δ32突變的mRNA也可能被NMD所降解，從而降低淋巴細胞膜表面CCR5的表達量，導致無法發(fā)揮HIV輔助受體的功能。也有研究發(fā)現(xiàn)CCR5Δ32突變蛋白有利于機體自行清除HCV肝炎引發(fā)的炎癥效應(yīng)[36]。也有研究發(fā)現(xiàn)，CCR5Δ32可以增加HBV感染后的恢復(fù)和降低大約50%的HBV慢性感染后的病程發(fā)展[7]。

終上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CCR5Δ32突變在中國不同民族群體中較為罕見，總體上說CCR5Δ32基因突變在北方群體分布較多，南方群體中頻率幾乎為0，CCR5Δ32突變頻率符合“北高南低”的趨勢。本研究結(jié)果有助于了解CCR5Δ32突變在中國不同地區(qū)人群中的分布情況，為不同人群遺傳背景和病原驅(qū)動的選擇壓力研究提供一定的數(shù)據(jù)。