Flavaglines類化合物對人白血病HEL細胞的作用及機制*

龍群， 肖瀟， 宋晶睿， 饒青， 苑春茂， 何志旭， 李艷梅**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室 & 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

白血病是由于基因突變導(dǎo)致造血干細胞或造血祖細胞惡性克隆增生的一種血液腫瘤，全世界每年至少有54 000人被診斷為白血病，5年存活率低于60%；據(jù)2018年全球數(shù)據(jù)表明，960萬癌癥相關(guān)死亡病例中白血病死亡病例占比3.2%[1-2]。白血病對人類健康的威脅主要是因為惡性增殖、凋亡受阻和分化障礙等因素可形成白血病細胞，而后在骨髓和肝脾等組織器官中大量增殖、廣泛浸潤，最終導(dǎo)致白血病患者出現(xiàn)貧血、出血、發(fā)熱、易感染、肝脾淋巴結(jié)腫大及疼痛等臨床表現(xiàn)[3]。目前白血病主要有化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療及干細胞移植等治療方法[4-5]，部分白血病患者的預(yù)后可以得到極大的改善，相當多的患者可獲得治愈或者長期穩(wěn)定緩解；但也有部分病人在臨床治療過程中會復(fù)發(fā)、藥物抗性和發(fā)生其它副作用[6]，因此白血病的治療仍然是大家關(guān)注的重點之一?？茖W(xué)家正不斷探索新的針對白血病的化療藥物，其中靶向貓肉瘤病毒麥克唐納株[Feline sarcoma virus (strain McDonough)，F(xiàn)MS]樣的酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)lt3)的米哚妥林(protein kinase C 412，PKC412)已于2017年獲得批準上市[7]，另外靶向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/Erk kinase , MEK)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL-2)基因、腫瘤蛋白53(tumour protein 53, TP53)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)等抑制劑藥物也正在研究中[8-9]。Flavaglines是一類具有環(huán)戊烷苯并呋喃骨架的復(fù)雜天然產(chǎn)物[10]，在腫瘤細胞中具有良好活性，但是對非腫瘤細胞卻幾乎沒有毒性或是毒性很小[11-12]，因此受到了化學(xué)家和生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。雖然Flavaglines在腫瘤細胞中的活性報道已經(jīng)很多，但其對白血病中的作用機制研究并不多，尤其是在人白血病細胞系(human erythroleukemia，HEL)細胞中的研究更少，因此本研究主要對Flavaglines類化合物(M8、M9)在白血病HEL細胞中抑制增殖的作用及機制進行初步研究，以擴大抗白血病藥物研究的藥庫。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1化合物及細胞株 Flavaglines(M8和M9)由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室苑春茂老師課題組合成，阿霉素(10 mg/支)購于中國碧云天公司；HEL細胞由加拿大多倫多大學(xué)惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清購于美國VACCA公司，RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Giboc公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于上海Sangon公司，四唑鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)試劑、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液(immunol precipitation, IP)及蛋白酶抑制劑(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)購于北京索萊寶公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司，Bcl-2及c-Myc抗體購于美國Abcam公司，Caspase 3和磷酸化信號傳導(dǎo)與活化轉(zhuǎn)錄因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-Stat3)購于美國CST公司，GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)購于中國正能；3111細胞培養(yǎng)箱和1384型A2型超凈工作臺購于美國Thermo公司，Axio Vert A1倒置顯微鏡購于美國ZEISS公司，Synergy 2Multi-ModeReader多功能酶標儀購于美國BioTek公司，NovoCyte 2040R流式細胞儀購于美國ACEA公司。

1.2 方法

1.2.1HEL細胞培養(yǎng) HEL細胞使用含5%血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測化合物活性 取處于對數(shù)生長期的HEL細胞計數(shù)均勻鋪板于96孔板中，細胞濃度為6 000個/孔；陽性對照藥阿霉素(0.100、0.050、0.030、0.010及0.006 μmol/L)、化合物M8(0.20、0.10、0.05、0.03及0.01 μmol/L)和M9(2.50、1.25、0.63、0.30及0.16 μmol/L)，分別對HEL細胞作用72 h后，加入MTT試劑10 μL，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，3 000 r/min離心30 min，吸盡多余液體后再加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶160 μL；用多功能酶標儀在490 nm吸收光處讀取吸光度值(optical delnsity，OD)，計算各濃度藥物對HEL細胞的抑制率[抑制率(%)=(對照組OD-治療組OD)/對照組OD×100%]，運用Forecast通過抑制率計算半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的HEL細胞計數(shù)鋪板于6孔板中，細胞濃度為20×107個/L；根據(jù)1.2.2項下IC50分別設(shè)置化合物M8為0.20、0.05及0.02 μmol/L，化合物M9為1.00、0.50及0.25 μmol/L，均以DMSO組為對照，分別培養(yǎng)24、48及72 h；收集細胞，預(yù)冷PBS洗2次，采用Annexin V-FITC/PI 雙染法在流式細胞儀上檢測HEL細胞的凋亡率。

1.2.4Western blot檢測HEL細胞相關(guān)蛋白的表達 在HEL細胞生長到對數(shù)生長期時，收集細胞計數(shù)鋪板于60 mm×60 mm的小皿中，細胞濃度為50×107個/L。藥物組設(shè)置M8(0.20 μmol/L)和M9(1.00 μmol/L)，以DMSO為對照組，處理HEL細胞24 h后收集細胞，預(yù)冷PBS充分洗掉培養(yǎng)基；加蛋白酶抑制劑的IP裂解液(IP ∶PMSF=100 ∶1)冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，去除絮狀沉淀；BCA蛋白定量試劑盒測定提取的蛋白濃度，確定上樣量；用5×SDS buffer，95 ℃變性5 min；按蛋白質(zhì)分子量進行100 V SDS-PAGE電泳120 min，膠上的蛋白質(zhì)用220 mA的恒流，120 min 轉(zhuǎn)到PVDF 膜，3%BSA室溫封閉1 h，孵育一抗Bcl-2、Caspase3、p-Stat3、c-Myc及GAPDH(4℃過夜)；孵育一抗完成后用1×TBS洗3次，室溫敷二抗2 h(慢搖)，用1×TBS洗3次后用Odyssey 紅外成像儀上掃膜分析蛋白表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 化合物M8和M9的活性

化合物M8、M9的結(jié)構(gòu)如圖1所示，以環(huán)戊烷苯啶呋喃為基本骨架，R1=OH為化合物M8，R1=CL為化合物M9；MTT法檢測結(jié)果顯示，化合物M8(0.20、0.10、0.05、0.03及0.01 μmol/L)、M9(2.50、1.25、0.63、0.30及0.16 μmol/L)及阿霉素(0.100、0.050、0.030、0.010及0.006 μmol/L)對HEL細胞作用72 h后，對HEL細胞的抑制率均隨濃度的增加而增高(P<0.05或P<0.01)；通過計算，化合物M8、M9及阿霉素的IC50值分別為(0.02±0.010)μmol/L、(0.21±0.060)μmol/L及(0.06±0.001)μmol/L，與阿霉素和化合物M9比較，化合物M8在HEL細胞中的IC50值較小(P<0.01)。見圖2。

注：R1=OH，為M8；R1=Cl，為M9。

圖1 化合物M8和M9的結(jié)構(gòu)
Fig.1 Structure of compounds M8 and M9

注：與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖2 阿霉素、化合物M8、M9對HEL細胞作用72 h后的抑制率
Fig.2 Cell growth inhibition rates of doxorubicin, compounds M8 and M9 on HEL cells after 72 h of treatment

2.2 化合物M8和M9對HEL細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結(jié)果顯示，與各時間點DMSO組比較，化合物M8和M9組HEL細胞的凋亡率均隨濃度的增加而增高(P<0.05或P<0.01)。見圖3和圖4。

注：A為M8，B為M9。

圖3 化合物M8和M9對HEL細胞作用24、48及72 h時的流式細胞儀凋亡檢測結(jié)果
Fig.3 Apoptosis rates of compounds M8 and M9 on HEL cells after 24,48 and 72 h of treatment

注：A為M8，B為M9；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖4 化合物M8和M9對HEL細胞作用24、48及72 h的細胞凋亡
Fig.4 Apoptosis rates of compounds M8 and M9 on HEL cells after 24,48 and 72 h of treatment

2.3 化合物M8和M9對HEL細胞相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，化合物M8(0.20 μmol/L)和M9(1.00 μmol/L)組HEL細胞中Bcl-2、Caspase3、p-Stat3及c-Myc蛋白的表達減少(P<0.05或P<0.01)，Cleave-Caspase3蛋白明顯增加(P<0.01)。見圖5。

注：A為Western blot檢測結(jié)果；B為蛋白相對表達量直條圖；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖5 化合物M8和M9作用24 h后HEL細胞相關(guān)蛋白的表達
Fig.5 Expression levels of related proteins of compounds M8 and M9 on the on HEL cells after 24 h of treatment

3 討論

本研究結(jié)果顯示，化合物M8、M9及陽性對照藥阿霉素對HEL細胞作用72 h后，抑制HEL細胞增殖的抑制率均隨濃度的增加而增高，與DMSO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)，72 h的IC50值分別為(0.02±0.010)μmol/L、(0.21±0.060)μmol/L及(0.06±0.001)μmol/L，與阿霉素和M9比較，化合物M8在HEL細胞中的IC50值較小(P<0.01)，提示化合物M8在HEL細胞中的活性優(yōu)于陽性對照藥阿霉素及化合物M9；流式細胞儀結(jié)果顯示，化合物M8、M9對HEL細胞分別作用24、48及72 h后均能促進HEL細胞發(fā)生凋亡，凋亡率也隨濃度的增加而增高，與各時間點DMSO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示化合物M8、M9可以通過促進HEL細胞凋亡發(fā)揮抗白血病作用。在蛋白水平上，化合物M8、M9能夠抑制Bcl-2、Caspase3、p-Stat3及c-Myc蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)，并使Cleave-Caspase3明顯增多(P<0.01)，說明化合物M8、M9可通過調(diào)控Stat3/c-Myc信號通路來促進白血病HEL細胞凋亡。

已知，Bcl-2蛋白是細胞內(nèi)源性凋亡的主要調(diào)節(jié)因子，與線粒體損傷的細胞凋亡密切相關(guān)[13]。事實上，Bcl-2已經(jīng)成為刺激各種癌細胞凋亡的最有價值的靶點之一[14-15]。如靶向Bcl-2的ABT-737、Navitoclax和Venetoclax等小分子抑制劑在體內(nèi)和體外都顯示了良好的療效[16-17]。而Caspase3的激活則是啟動凋亡程序的必經(jīng)之路[18]。由此可見，F(xiàn)lavaglines(M8和M9)可通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2來激活Caspase3蛋白，從而促進白血病HEL細胞凋亡，而不是細胞壞死。凋亡是細胞的一種程序性死亡，與細胞壞死不同，凋亡細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，如細胞皺縮、核凝結(jié)、DNA斷裂及膜泡形成等，但不破壞細胞膜的完整性，對細胞周圍產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)很輕[19]，這在腫瘤的治療上具有重要意義，因此目前很多抗腫瘤藥物的研究都是從誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制入手[20-22]。

在前期的研究中，F(xiàn)lavaglines主要是通過抑制翻譯起始因子eIF4A調(diào)控MAPK信號通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[23-24]，但本研究結(jié)果顯示化合物M8和M9可以使p-Stat3明顯減少(P<0.01)。已知，Stat3是一種信號傳導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子，在細胞中起到傳遞信號和啟動基因轉(zhuǎn)錄的雙重作用[25]，Stat3信號異?？赏ㄟ^抑制細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘發(fā)炎癥等促進腫瘤的發(fā)生和進展，更關(guān)鍵的是在腫瘤耐藥方面中扮演了重要角色[26]。許多研究已證明Stat3在白血病、乳腺癌、胃癌及肺癌等多種人類腫瘤中過度激活，并與預(yù)后相關(guān)[25-28]。因此，鑒定和開發(fā)靶向抑制Stat3激活的新型藥物已經(jīng)成為一個腫瘤治療的方向[29]。本研究結(jié)果還顯示，M8和M9可以明顯抑制c-Myc蛋白的表達(P<0.01)。c-Myc蛋白是一種經(jīng)典的原癌蛋白，在造血干細胞的自我更新、增殖、分化中起重要調(diào)控作用，但在大多數(shù)腫瘤中過度表達[30]；同時c-Myc蛋白又是由Stat3下游靶點基因c-myc編碼表達的蛋白質(zhì)，因此抑制p-Stat3/c-Myc的表達，對腫瘤的治療尤其是白血病的治療具有重要意義[31]。

綜上所述，F(xiàn)lavaglines化合物M8、M9對白血病HEL細胞均具有良好的活性，且M8活性優(yōu)于陽性藥阿霉素和M9；初步探討了Flavaglines化合物M8、M9作用于Stat3/c-Myc信號通路促進白血病HEL細胞凋亡的機制，提示化合物M8、M9在抗白血病治療中具有潛在的應(yīng)用價值，其具體的抗白血病分子機制值得進一步研究。