CalothrixinB衍生物對白血病K562細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制*

龍群， 肖瀟， 宋晶睿， 饒青， 劉晟， 何志旭， 李艷梅**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室 & 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550014； 3.貴州省中國科學(xué)院 天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550014)

白血病是一組以造血干細(xì)胞異常增殖和分化受阻為特點(diǎn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，分為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocyte leukemia, ALL)及慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CML)，其中AML和CML是常見的白血病惡性血液病[1-2]。人類白血病細(xì)胞系K562是一種造血祖細(xì)胞，已被廣泛用于CML的研究，它是由一名CML患者建立的細(xì)胞系[3-4]。CML是一種以費(fèi)城(Ph)染色體為特征的骨髓增生性疾病，分為慢性期、加速器和急變期，在美國，CML在成人中約占新診斷疾病的15%[5]。Ph染色體是由22號染色體長臂易位到9號染色體長臂上，使斷點(diǎn)簇區(qū)域激酶(breakpoint cluster region kinase,BCR)基因與Abelson激酶(abelson kinase,ABL)基因形成融合基因，編碼的BCR-ABL融合蛋白可以激活多種下游信號通路，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)、蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，從而抑制造血祖細(xì)胞分化，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和抵抗凋亡，并破壞遺傳穩(wěn)定性[6-7]。目前已經(jīng)有很多藥物被開發(fā)用來治療CML，其中酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是一項重要的發(fā)現(xiàn)，尤其是伊馬替尼的使用，CML已成為一種可控制的、長期存活率超過85%的慢性疾病[8]。然而在臨床中，由于BCR-ABL突變、BCR-ABL過表達(dá)及其他獨(dú)立于BCR-ABL的信號通路存在，大約15%～20%的CML患者最終會形成對伊馬替尼的耐藥性，然后進(jìn)入加速階段，最后達(dá)到急變期[9-10]；而一旦CML患者發(fā)展到無法控制的程度，治療會更加困難[11]，因此對CML的治療依然需要不斷的研究探索。CalothrixinB是一種具有潛在抗增殖活性的眉藻藍(lán)細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物，它不僅對人HeLa細(xì)胞具有納摩樂級的生長抑制作用，而且在體外還能抑制抗氯喹瘧原蟲的生長，但是其對髓系白血病細(xì)胞活性較差，經(jīng)過修飾改造后又可有較好活性[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室合成了一系列CalothrixinB的衍似物，通過篩選，本研究選出了L20(圖1) 這個對K562細(xì)胞株具有活性的化合物，采用該化合物處理K562細(xì)胞，觀察處理后K562細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化進(jìn)一步研究其抑制K562細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及主要儀器

人慢性髓系白血病K562細(xì)胞株來自于美國ATCC細(xì)胞庫。用含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2、濕度為95%的恒溫箱中進(jìn)行孵育。L20是由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉晟老師合成，分子量為 462 kD，化學(xué)式如圖1，純度大于 95%的一個CalothrixinB 衍生物。RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Giboc公司，胎牛血清購于美國VACCA 公司，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于 Sangon 生物技術(shù)公司，細(xì)胞濃度的DMSO、四唑鹽(MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide])試劑、細(xì)胞周期染料(propidium iodide, PI)、BCA(bicinchoninic acid) 蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞裂解液(immunol precipitation, IP)、蛋白酶抑制劑(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)和彩虹245光譜蛋白Marker (11-245kD) 購于北京索萊寶公司，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購于BD 公司，RNA酶抑制劑購于日本Takara公司，活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購于北京碧云天公司。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, BCL-2)(ab 32124)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X(BCL2-Associated X, BAX)(ab 32503)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)(ab 131450)、 磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(phosphorylation-cyclin-dependent kinases 1, p-CDK1) (ab 47594)抗體購于Abcam公司，細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cyclin 25 homolog C,Cdc25C)(4688)、 磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(Phosphorylation-cell division cyclin 25 homolog C, p-Cdc25C)(9528)、剪切的Caspase3 (9662)、Caspase 9(9502)、多聚 (腺苷二磷酸核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)(9542)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated,ERK)(4695)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylation-extracellular regulated,p-ERK)(4370)購于CST公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(301341) 購于中國正能。細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111)，超凈工作臺(1384型 A2型)購于美國Thermo公司，倒置顯微鏡(Axio Vert A1)購于美國ZEISS公司，多功能酶標(biāo)儀(Synergy 2Multi-ModeReader)購于美國BioTek公司，流式細(xì)胞儀(NovoCyte 2040R)購于美國ACEA公司。

圖1 化合物L(fēng)20的結(jié)構(gòu)和分子量Fig.1 Structure and molecular weight of compound L20

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測K562細(xì)胞存活率 將處于對數(shù)期生長的K562細(xì)胞鋪于96孔板中,細(xì)胞濃度為6 000個/孔，體積為90 μL。L20濃度分別按10.00、5.00、2.50、1.25、0.63 mmol/L倍比稀釋，DMSO為對照組，每個濃度同時做5個重復(fù)。在每孔中分別加入10 μL稀釋后的藥物 ，拍勻后置于恒溫箱中培養(yǎng)72 h。用普通光學(xué)顯微鏡拍取 細(xì)胞形態(tài)后， 在每孔中加入 MTT 10 μL，混勻后繼續(xù)放入溫箱中孵育4 h，用3 000 r/min離心30 min，輕輕將上清吸盡，然后每孔中加入 DMSO 160 μL ，置于搖床上，37 ℃、150 r/min搖15 min；待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度值(OD)。然后用公式計算各濃度藥物對K562細(xì)胞的抑制率：抑制率=(對照組A490 nm-治療組A490 nm)/對照組A490 nm×100%。

1.2.2Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡 將處于對數(shù)期生長的K562細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，每孔的細(xì)胞濃度為10×107/L，體積為2 mL。每孔加入2 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h，48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍后，再用1×Binding buffer 50 μL重懸，然后分別加入Annexin V-FITC和PI 2.5 μL，混勻后避光染色15 min，然后離心去染料，1×Binding buffer 200 μL重懸后用艾森 NovoCyte 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將處于對數(shù)期生長的K562細(xì)胞以50×107/L 鋪于60 mm×60 mm的皿中，體積為3 mL，每皿中加入3 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍，再加入500 μL預(yù)冷70%乙醇，-20 ℃過夜。離心去除乙醇，再用預(yù)冷 PBS 洗2次，然后在每管中加入 500 μL 細(xì)胞周期染液[RNaseA (100 mg/L)+PI(50 mg/L)+Triton X-100(0.2%)]混合物?；靹蚝蟊芄?，37 ℃孵育20 min。離心去除染料，再用預(yù)冷PBS洗兩次，然后用200 μL PBS重懸，過濾后用艾森 NovoCyte 流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。

1.2.4ROS的檢測 為了研究L20誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與線粒體的損傷有關(guān)，本研究用活性氧試劑盒來檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。將處于對數(shù)期生長的K562細(xì)胞以50×107/L鋪于60 mm×60 mm的皿中，每皿3 mL，每皿加入濃度3 μL分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，并以DMSO為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，按試劑盒說明書進(jìn)行探針裝載，然后用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。

1.2.5Western蛋白印跡 將處于對數(shù)期生長的K562細(xì)胞以50×107/L鋪于60 mm×60 mm的皿中，每皿3 mL。每皿加入3 μL濃度分別為10.00、5.00及2.50 mmol/L的L20，以DMSO為對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液(IP ∶PMSF=100 ∶1)，混勻置于冰上30 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確定上樣量。然后用5×SDS buffer，95 ℃變性6 min。取50 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，220 mA，120 min 轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，然后用3%的BSA封閉1 h，4 ℃過夜敷一抗，1×TBS 洗3遍，室溫敷二抗1 h，1×TBS 再洗3遍，然后用Odyssey 紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 L20對K562細(xì)胞增殖抑制的影響

MTT結(jié)果顯示，K562細(xì)胞經(jīng)L20(10.00、5.00、2.50、1.25及0.63 μmol/L)處理 72 h后，與DMSO組比較，L20組抑制率隨濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，通過計算，L20對K562細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)為(5.46±3.09)μmol/L(圖2A)。普通顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，K562細(xì)胞經(jīng)L20處理72 h后，與DMSO組比較，L20組(10.00、5.00、2.50及1.25 μmol/L)K562細(xì)胞數(shù)量減少、形態(tài)發(fā)生變化，并有細(xì)胞死亡碎片產(chǎn)生(圖2B)。

注：A為L20(10.00、5.00、2.50、1.25及0.63 μmol/L) 對K562細(xì)胞作用72 h的抑制率，B為L20(10、5、2.50、1.25及0.63 μmol/L) 對K562細(xì)胞作用72 h后細(xì)胞形態(tài)的改變，放大倍數(shù)(×200 )；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖2 化合物L(fēng)20對K562細(xì)胞增殖的抑制作用(72 h)
Fig.2 Growth inhibition of K562 cells effected by compound L20(72 h)

2.2 L20對 K562細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，L20(10.00、5.00、2.50 μmol/L)分別處理K562細(xì)胞24 h和48 h后，與DMSO組比較，L20組K562細(xì)胞凋亡率隨濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

2.3 L20對 K562細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示，L20(10.00、5.00、2.50 μmol/L)作用于K562細(xì)胞24 h后，與DMSO組比較，L20組K562細(xì)胞處于G2/M期的比例隨濃度的增加而增加(P<0.01)，處于G1期和S期的K562細(xì)胞則隨濃度的增加而減少(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

2.4 L20對K562細(xì)胞ROS的影響

結(jié)果顯示，L20(10.00、5.00、2.5 μmol/L)作用于K562細(xì)胞24 h后，與DMSO組比較，加藥組顯示綠色熒光的細(xì)胞數(shù)變多并且熒光強(qiáng)度增加，說明L20可以增加ROS在K562細(xì)胞中的累積。見圖5。

注：A為流式細(xì)胞儀分析的凋亡結(jié)果，B為凋亡率統(tǒng)計圖。與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖3 L20對K562細(xì)胞作用24 h、48 h時的細(xì)胞凋亡率
Fig.3 Apoptosis of K562 cells effected by compound L20 after 24 h and 48 h

注：A為流式細(xì)胞儀分析的周期分布結(jié)果，B為細(xì)胞周期統(tǒng)計圖。與DMSO組同周期比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

圖4 L20對K562細(xì)胞作用24 h時的細(xì)胞周期變化
Fig.4 Cell cycle of K562 cells effected by compound after 24 h

注：箭頭所示為陽性細(xì)胞。

圖5 L20作用于K562細(xì)胞24 h后對ROS的影響(熒光染色，×400)
Fig.5 ROS of K562 cells effected by compound L20 after 24 h(microscope，×400)

2.5 L20對K562細(xì)胞凋亡和周期蛋白的影響

L20對K562細(xì)胞凋亡和周期蛋白影響的結(jié)果顯示，K562細(xì)胞經(jīng)L20處理24 h后，與DMSO組比較，磷酸化ERK減少，抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)減少，促凋亡蛋白BAX表達(dá)增加，剪切的Caspase 9、Caspase 3和PARP均增加(圖6-A)；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白磷酸化CDK1和總的CDC25C增加，磷酸化CDC25C減少(圖6-B)。

注：A為凋亡相關(guān)蛋白，B為周期相關(guān)蛋白

圖6 L20作用于K562 24 h后對凋亡周期蛋白的影響
Fig.6 Expression levels of apoptosis-and cyclin-related proteins of K562 cells effected by compound after 24 h

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與對照組DMSO比較，化合物L(fēng)20作用于K562細(xì)胞后，抑制率隨著濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，且在顯微鏡下觀察到細(xì)胞數(shù)量減少，說明L20能夠抑制K562細(xì)胞的增殖；凋亡率隨著濃度的增加而增加(P<0.05或P<0.01)，細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期的比例也隨濃度的增加而增加(P<0.01)，說明L20可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；化合物L(fēng)20作用于K562細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS增多，提示L20誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與線粒體相關(guān)；在蛋白水平上，磷酸化ERK減少，調(diào)控凋亡及G2/M期的相關(guān)蛋白表達(dá)也發(fā)生了變化，進(jìn)一步揭示了L20誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制。

腫瘤的發(fā)生是由于基因突變使細(xì)胞增殖與死亡之間的穩(wěn)態(tài)被破壞從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可控制的生長，因此在研究抗腫瘤藥物時，通常將凋亡和周期阻滯作為抗腫瘤的兩大指標(biāo)[14-15]。凋亡由線粒體和死亡受體兩條途徑介導(dǎo)，其中BCL-2家族成員是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的重要蛋白，包括促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL-2[16-17]。BAX的增加和BCL-2的減少可以在線粒體上形成小孔道，使線粒體中的細(xì)胞色素C釋放到胞漿，細(xì)胞色素C又能激活執(zhí)行凋亡程序的Caspase 3、Caspase 9，使剪切的Caspase 3和Caspase 9增多，最終DNA修復(fù)酶PARP被Caspase3裂解，使剪切的PARP增多[18-19]。另外，線粒體中活性氧的堆積也會使線粒體膜電位發(fā)生改變，使線粒體膜通透性增加，致使細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來[20]。從本研究的結(jié)果可看出，L20抑制了抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，并增加促凋亡蛋白BAX的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生，提示L20誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡與ROS參與的線粒體凋亡途徑相關(guān)。有文獻(xiàn)報道p-CDC25C下調(diào)可以抑制CDK1/CyclinB1復(fù)合體的活性，CDK1/CyclinB1復(fù)合體的激活是調(diào)控細(xì)胞周期從G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵復(fù)合物，其報道還稱細(xì)胞內(nèi)p-CDK1和CyclinB1的積累是無活性CDK1/CyclinB1復(fù)合物存在的證據(jù)[21]，因此化合物L(fēng)20通過下調(diào)p-CDC25C的活性來抑制CDK1/CyclinB1復(fù)合體的活性使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

ERK/MAPK通路被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPK信號級聯(lián)，它在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能[22-23]。在CML K562細(xì)胞中由于BCR-ABL融合基因的表達(dá)，使MAPK通路異常激活，并且有研究證明ERK1/2 MAPK通路的異常激活與CML患者的生存和耐藥具有密切聯(lián)系[24-25]，因此抑制ERK的活性對CML的治療也有十分重要的意義，說明L20有成為抗腫瘤藥物的潛能。

綜上所述表明，L20可以通過抑制ERK/MAPK通路，調(diào)控BAX/BCL-2的表達(dá)及ROS的生成來誘導(dǎo)K562細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡，并通過下調(diào)p-CDC25C活性來抑制CDK1/CyclinB1復(fù)合體的活性將K562細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而發(fā)揮抗腫瘤增殖活性，說明CalothrixinB衍生物L(fēng)20有希望成為抗腫瘤化合物研究的候選化合物。但本研究沒有確切找到L20的上游靶點(diǎn)，也沒有在動物體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，因此下一步打算更深入的挖掘其上游靶點(diǎn)及進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在化學(xué)方面也希望能以此化合物為基礎(chǔ)衍生出活性更好的化合物。本研究雖然存在一定的局限性，但第一次發(fā)現(xiàn)了CalothrixinB衍生物L(fēng)20 在CML K562細(xì)胞中的作用及機(jī)制，為臨床上研究新藥物提供了新方向。