褪黑素減輕大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

楊根歡 汪 巖 廖鵬志 賈玉龍

隨著經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步和人群膳食結(jié)構(gòu)的改變，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)。因而血管相關(guān)性疾病的發(fā)生率越來(lái)越高，尤其是心腦血管疾病已成為重要的致死、致殘的原因之一。動(dòng)脈粥樣硬化最基本的病理變化便是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[1]。褪黑素在體內(nèi)分布廣泛，相對(duì)分子質(zhì)量較小，可以自由通過(guò)細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)[2]。已有研究表明，褪黑素具有強(qiáng)大的抗炎和抗氧化功能[3]。本研究表明，褪黑素能夠抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中相關(guān)炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕球囊損傷誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。

材料與方法

1.材料與試劑：SPF級(jí)雄性SD大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，褪黑素(美國(guó)Sigma公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，NF-κB抗體(美國(guó)CST公司)，MCP-1抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；ICAM-1抗體和VCAM-1抗體(中國(guó)博士德生物工程有限公司)。

2.球囊損傷模型的制備及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：20只SPF級(jí)的雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量為350g。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)大鼠分為正常對(duì)照組、正常并注射褪黑素組、球囊損傷組、球囊損傷并注射褪黑素組，每組5只。將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后行頸部正中切口，解剖出頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈并套線備用，將頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)端及其分支結(jié)扎。將頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈阻斷，將頸外動(dòng)脈用顯微剪刀剪開，將2F的取栓球囊插入頸總動(dòng)脈內(nèi)約2cm。將0.05ml的0.9%NaCl注射液注入取栓球囊內(nèi)，充盈后拖至頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)端，如此反復(fù)3次，隨后行頸外動(dòng)脈的斷端結(jié)扎，逐層縫合頸部切口。按照預(yù)定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定時(shí)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠分別行腹腔內(nèi)注射褪黑素(5mg/kg)及同體積的0.9%NaCl注射液，每日1次[4]。14天后取出各組實(shí)驗(yàn)大鼠的球囊損傷段頸動(dòng)脈。0.9%NaCl注射液將頸動(dòng)脈沖洗干凈，將頸動(dòng)脈一分為二，分別保存于4%的多聚甲醛和液氮中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)方法對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟及水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液浸泡后行高壓、高溫修復(fù)抗原，室溫下用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10min以滅活內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶，然后室溫下用5%的山羊血清封閉30min。一抗4℃下孵育過(guò)夜(CD45 1∶50)，二抗室溫下孵育60min。DAB法染色，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。終止染色后用蘇木精復(fù)染5min，0.1%鹽酸乙醇分化3～5s，自來(lái)水沖洗返藍(lán)2min，然后常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、封片。將免疫組織化學(xué)的切片置于光學(xué)顯微鏡下拍照(×400)，用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)CD45陽(yáng)性區(qū)域的平均吸光度值進(jìn)行分析，將相應(yīng)數(shù)值用于統(tǒng)計(jì)分析。

4.Western blot法檢測(cè)：將大鼠的頸動(dòng)脈標(biāo)本加入600μl SDS組織裂解液，置于研缽中，研磨成組織勻漿，常規(guī)方法提取組織蛋白并測(cè)定蛋白濃度。將總量為20μg的蛋白上樣，120V的恒壓下電泳約90min，320mA的恒流下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h，4℃下一抗孵育12h(NF-κB 1∶2000,MCP-1 1∶2000,ICAM-1 1∶500，VCAM-1 1∶500)，TBST洗膜3次，在室溫下二抗(濃度1∶5000)孵育1h，之后應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。用Alpha EaseFC system 軟件(美國(guó)Alpha Innotech公司)對(duì)Western blot法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，分別測(cè)量目標(biāo)蛋白和相應(yīng)內(nèi)參的灰度值，將其比值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié) 果

1.各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況：球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度顯著高于正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度顯著低于球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.01，圖1)。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況(CD45免疫組化染色，×400)A.正常對(duì)照組；B.正常+褪黑素組；C.球囊損傷組；D.球囊+褪黑素組；E.與正常對(duì)照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.01

2.各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)NF-κB的表達(dá)情況：球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)NF-κB的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)NF-κB的表達(dá)顯著低于球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.01，圖2)。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)NF-κB的表達(dá)與正常對(duì)照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.01

3.各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)情況：球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.01)。球囊損傷并注射褪黑素組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)顯著低于球囊損傷組實(shí)驗(yàn)大鼠(P<0.05，圖3)。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的頸動(dòng)脈內(nèi)MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)與正常對(duì)照組或正常+褪黑素組比較，*P<0.01；與球囊損傷組比較，#P<0.05

討 論

隨著人類的疾病譜的改變，社會(huì)對(duì)血管疾病的認(rèn)識(shí)和重視程度也越來(lái)越高。而炎癥作為一重要的病理生理過(guò)程參與了很多常見血管病的發(fā)生，甚至在某些血管病中可以作為最主要的病理改變，如動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性大動(dòng)脈炎和白塞病等[5,6]。褪黑素作為體內(nèi)重要的內(nèi)分泌物質(zhì)，能夠被體內(nèi)很多器官合成。褪黑素具有調(diào)節(jié)人體的生物節(jié)律、調(diào)節(jié)腸道的功能、抑制腫瘤的生長(zhǎng)、抗炎性損傷和抗氧化損傷等重要生理功能[7,8]。目前國(guó)內(nèi)外普遍將褪黑素應(yīng)用于調(diào)節(jié)人體睡眠及腸道生理功能方面，效果顯著且無(wú)明顯的毒性不良反應(yīng)。已有研究表明，在很多血管疾病中褪黑素具有重要的血管保護(hù)作用，如尼古丁誘導(dǎo)的血管病、低氧所致的血管損害以及高血壓相關(guān)的血管損傷等[4,9]。

炎癥的本質(zhì)是炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，即血管壁內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度能夠反映其炎性損傷的程度[10]。CD45是組織內(nèi)炎性細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，因此本研究通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)的CD45陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目來(lái)反映其炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度及炎性損傷的程度[11]。大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷可引起動(dòng)脈內(nèi)膜的增生和動(dòng)脈壁的炎性反應(yīng)，因此本研究用此經(jīng)典動(dòng)物模型研究褪黑素對(duì)動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。結(jié)果表明，球囊損傷能明顯誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈壁內(nèi)的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，而褪黑素可以抑制此炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。同時(shí)本研究尚對(duì)褪黑素抑制實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈壁內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制進(jìn)行了探討。

MCP-1是組織內(nèi)炎性細(xì)胞的重要趨化因子之一，VCAM-1和ICAM-1是組織細(xì)胞間重要的黏附因子[12～14]。因此MCP-1、VCAM-1和ICAM-1均能夠參與炎性細(xì)胞向血管壁的黏附和浸潤(rùn)。而NF-κB作為重要的炎性因子則能夠誘導(dǎo)MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)[15,16]。結(jié)合本研究結(jié)果可以推斷，褪黑素能夠通過(guò)抑制NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)進(jìn)而減輕球囊損傷誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)大鼠頸動(dòng)脈壁內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。有研究表明，將大鼠的松果體切除后，發(fā)現(xiàn)其主動(dòng)脈內(nèi)MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)顯著升高，這與本研究的結(jié)果類似[17]。同時(shí)本研究也顯示，褪黑素在治療炎癥相關(guān)的血管病方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。