右美托咪定對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB/NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的影響

李鮮風(fēng) 楊麗絹

子宮內(nèi)膜炎是女性常見的生殖道疾病，其特點(diǎn)是子宮內(nèi)膜的持續(xù)性炎性反應(yīng)，并引起許多生育問題，包括自發(fā)性早產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等[1]。脂多糖(LPS)作為革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分，是誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎的關(guān)鍵因素[2]。

Toll樣受體(TLR)是一類細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體(PRR)，通過識(shí)別脂多糖(LPS)、膜脂蛋白等分子參與機(jī)體的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[3]。TLR4是TLR家族重要的成員之一，能夠識(shí)別外源性配體LPS[4]。LPS與TLR4結(jié)合能夠引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，如激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路，NF-κB信號(hào)活化能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)錄，包括NLRP3炎性小體相關(guān)分子及細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α)的表達(dá)[5]。NLRP3炎性小體是細(xì)胞內(nèi)的重要胞質(zhì)識(shí)別受體，主要成分包括NLRP3、caspase-1、ASC等[6]。NLRP3炎性小體活化后，其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-1β和IL-18，加重炎性反應(yīng)[7]。因此，抑制TLR4-NF-κB信號(hào)介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化對(duì)于炎性疾病的治療具有潛在的價(jià)值。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種有效的選擇性α-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的效果[8]。近年來，研究表明DEX能夠通過阻斷NF-κB信號(hào)通路對(duì)脊髓損傷、心肌缺血再灌注及膿血癥等模型發(fā)揮良好的抗炎效果[9]。但是DEX對(duì)子宮內(nèi)膜炎的作用和相關(guān)分子機(jī)制尚未完全清楚，因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮內(nèi)膜炎模型探索DEX的抗炎作用及相關(guān)分子機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：脂多糖(LPS)(美國(guó)西格瑪奧德里奇公司)；HE染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-1β、IL-18、TNF-α 小鼠ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；caspase-1、ASC及NLRP3抗體(美國(guó)細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司)；TLR4、p-p65、p65、GAPDH抗體(上海艾博抗貿(mào)易有限公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IG(美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)，右美托咪定注射劑(江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

2.動(dòng)物分組給藥及小鼠子宮內(nèi)膜炎模型建立：所有動(dòng)物試驗(yàn)均經(jīng)過動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的同意和批準(zhǔn)，將40只C57BL/6小鼠(雌性，20～22g)隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、右美托咪定組(10、20、40μg/kg)，每組8只，右美托咪定腹腔注射給藥，對(duì)照組和模型組給予等體積的0.9%NaCl注射液。給藥后30min，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，倒提固定，用自制小鼠子宮灌注器向小鼠子宮內(nèi)注射LPS(5mg/ml，溶解于PBS溶液)20μl，對(duì)照組注射等體積PBS溶液。在LPS注射24h后，眼球取血，脫頸椎處死，解剖分離小鼠子宮組織。

3.HE病理染色：分離收集小鼠子宮組織，切取約0.5cm，置于中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成4μm薄片，蘇木精-伊紅(HE)染色觀察子宮組織的病理變化，并評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)水腫：正常為0分；輕微為1分；適中為2分；嚴(yán)重為3分。(2)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)：0～1為0分；2～5為1分；6～10為2分；11～15為3分；16～20為4分；>20為5分。

4.ELISA法：采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α的分泌水平，小鼠眼球取血，用1.5ml EP管收集血液，4℃靜置過夜，3000r/min離心5min，吸取上清，使用ELISA試劑盒根據(jù)制造商說明檢測(cè)小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α的含量。

5.RT-PCR檢測(cè)：分離收集小鼠子宮組織，稱取約30mg，加入1ml TRIzol(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取組織總RNA，用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)總RNA的純度和濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA(1μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用配有SYBRs Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)的CFX ConnectTMReal-Time系統(tǒng)(美國(guó)伯樂公司)進(jìn)行qRT-PCR定量分析，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，60℃延伸30s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算IL-18、IL-1β、TNF-α、GAPDH mRNA的表達(dá)水平，RT-PCR引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列

6.蛋白印跡免疫分析(Western blot法)：分離收集小鼠子宮組織，稱取約30mg，采用Western blot法檢測(cè)子宮組織中caspase-1、ASC、NLRP3、TLR4、p-p65及p65的蛋白表達(dá)水平。根據(jù)制造商說明操作提取組織總蛋白，采用BCA法(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對(duì)蛋白進(jìn)行定量，加入Loading buffer(4X)于100℃煮沸5min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳來達(dá)到分離蛋白的目的，電泳條件：80V，30min；120V，60min。隨后采用100V，90min將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(美國(guó)密理博公司)，用5%脫脂奶粉封閉60min，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用一抗(caspase-1、ASC、NLRP3，按1∶1000稀釋；TLR4、p-p65、p65及GAPDH，按1∶500稀釋)4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IG，按1∶10000稀釋)孵育90min，TBST洗滌5次，5分鐘/次，用ECL化學(xué)發(fā)光法(Millipore，MA)顯影檢測(cè)，Image J分析灰度值，GAPDH用作內(nèi)參對(duì)照。

結(jié) 果

1.右美托咪定(DEX)對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織病理變化的影響：采用HE染色檢測(cè)小鼠子宮組織的病理變化情況，與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠的子宮組織中出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮肌層出現(xiàn)水腫，黏膜出現(xiàn)損傷和增生，同時(shí)炎癥評(píng)分顯著增加；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性緩解子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和子宮肌層水腫，并緩解子宮黏膜損傷，顯著減少炎癥評(píng)分(圖1)。

圖1 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織病理變化的影響A～E.HE染色;A.對(duì)照組；B.模型組；C～E.右美托咪定組(10、20、40μg/kg);F.子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織病理炎癥評(píng)分比較。與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

2.右美托咪定(DEX)對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中炎性因子分泌水平的影響：采用ELISA法檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中炎性因子的分泌水平，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的含量均顯著增加；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性降低子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的水平(圖2)。

3.右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中炎性因子表達(dá)水平的影響：采用RT-PCR法檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中炎性因子的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，模型組小鼠子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA的表達(dá)水平(圖3)。

圖2 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中炎性因子分泌水平的影響A.子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中IL-1β的水平；B.子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中IL-18的水平；C.子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中TNF-α的水平，與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

圖3 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中炎性因子表達(dá)水平的影響A.子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮中IL-1β mRNA的表達(dá)水平；B.子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮中IL-18 mRNA的表達(dá)水平；C.子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮中TNF-α mRNA的表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.01，##P=0.000

4.右美托咪定(DEX)對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體活化的影響：采用Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，模型組小鼠子宮組織中caspase-1、ASC及NLRP3的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性下調(diào)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中caspase-1、ASC及NLRP3的蛋白表達(dá)(圖4)。

圖4 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中NLRP3炎性小體活化的影響與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

5.右美托咪定(DEX)對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路活化的影響：采用Western blot法檢測(cè)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)水平，與對(duì)照組比較，模型組小鼠子宮組織中TLR4、p-p65/p65的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；與模型組比較，腹腔注射給予右美托咪定呈劑量依賴性下調(diào)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4、p-p65/p65的蛋白表達(dá)水平(圖5)。

圖5 右美托咪定對(duì)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4-NF-κB通路活化的影響與對(duì)照組比較，*P=0.000；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

討 論

子宮內(nèi)膜炎發(fā)生于女性的子宮內(nèi)膜，是一種常見的婦科疾病，其能夠引起包括不孕、流產(chǎn)在內(nèi)的諸多生育問題，這對(duì)患者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分，是誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎的關(guān)鍵因素，近年來LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于該疾病的研究[11]。右美托咪定(DEX)是一種選擇性α-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，其具有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠子宮注射LPS能夠引起小鼠子宮發(fā)生肌層水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性反應(yīng)，腹腔注射給予小鼠DEX能夠緩解子宮內(nèi)膜炎的發(fā)展，包括抑制子宮肌層水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，上述結(jié)果表明本研究成功建立了小鼠子宮內(nèi)膜炎模型，并表明DEX對(duì)治療子宮內(nèi)膜炎具有潛在的價(jià)值。

LPS通過激活先天性免疫反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的促炎信號(hào)，這些促炎信號(hào)在機(jī)體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[12]。但是，釋放過量的炎性因子能夠引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且損害組織[13]。因此，抑制炎性因子的產(chǎn)生對(duì)治療炎癥疾病具有重要意義。IL-1β是一種重要的促炎細(xì)胞因子，具有廣泛的全身和局部作用，并能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞功能[14]。TNF-α是一種急性期蛋白，可啟動(dòng)細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加血管通透性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞向感染部位募集，并參與炎癥疾病[15]。IL-18是一種前炎性細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的分泌，在免疫調(diào)節(jié)、感染性及慢性炎癥疾病過程中具有重要的作用。本研究表明DEX能夠顯著降低子宮內(nèi)膜炎小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α的水平，同時(shí)下調(diào)子宮組織中IL-1β、IL-18、TNF-α的表達(dá)水平，上述結(jié)果表明DEX對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療作用與下調(diào)子宮內(nèi)膜炎小鼠的炎性因子水平有關(guān)。

成熟的IL-1β和IL-18產(chǎn)生和分泌與NLRP3炎性小體活化密切相關(guān)，除此之外，IL-1β和TNF-α產(chǎn)生和分泌也是基于NF-κB信號(hào)通路活化的[16]。NLRP3炎性小體激活后，ASC和NLRP3結(jié)合誘導(dǎo)caspase-1聚集，自激活和促進(jìn)IL-1β和IL-18成熟[17]。本研究表明DEX能夠抑制子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中ASC、NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平，上述表明DEX的抗炎作用與抑制NLRP3炎性小體活化有關(guān)。

TLR4是TLR家族的成員，其作為L(zhǎng)PS的受體介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的活化，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)于調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化具有重要作用[18]。因此本研究假設(shè)DEX的抗炎作用與抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路活化有關(guān)。本研究結(jié)果表明DEX能顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜炎小鼠子宮組織中TLR4的表達(dá)水平。在正常情況下，p65與IκBα結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)LPS刺激時(shí)，IκBα將會(huì)磷酸化并降解，p65磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)核基因的轉(zhuǎn)錄，包括NLRP3炎性小體相關(guān)成分、IL-1β、IL-18、TNF-α，從而加重炎性反應(yīng)[19]。本研究表明DEX能夠通過下調(diào)p-p65/p65的表達(dá)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，上述結(jié)果表明DEX的抗炎作用可能與TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，本研究表明右美托咪定(DEX)腹腔注射給予子宮內(nèi)膜炎小鼠，能夠緩解小鼠子宮內(nèi)膜炎，并且與抑制子宮組織中TLR4-NF-κB/NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)，因此右美托咪定對(duì)于治療子宮內(nèi)膜炎具有潛在的價(jià)值。