淫羊藿女貞子配伍(4∶3)影響自然衰老大鼠脾臟及胸腺的研究

馬紫童 王雪帆 唐秀鳳 高瑩瑩 王 瀚 劉仁慧

隨著社會的發(fā)展、醫(yī)學(xué)的進步，人類平均壽命不斷增高，人口老齡化已成為全世界面臨的一個嚴(yán)重的社會問題[1]。延緩衰老以減輕衰老引發(fā)的慢性疾病在人口日益老齡化的中國尤其具有重要意義。有研究證實，自然衰老大鼠出現(xiàn)免疫器官胸腺及脾臟的增齡性退化，且與氧化損傷的累積有一定關(guān)系[2]。淫羊藿、女貞子是臨床常用的延緩衰老的補腎中藥，二者配伍具有平調(diào)腎中陰陽之功，是國家級名老中醫(yī)李世增教授積50余年的臨床經(jīng)驗所總結(jié)的，常用于治療衰老相關(guān)疾病的藥對。前期實驗研究表明，淫羊藿和女貞子配伍對于慢性衰老相關(guān)疾病骨質(zhì)疏松以及慢性肺部疾病哮喘均有顯著療效[3,4]。文獻(xiàn)報道，淫羊藿、女貞子均有良好的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用，但對于衰老過程中免疫器官的退化及氧化損傷的作用尚未有研究[5,6]。本研究基于上述認(rèn)識，選擇自然衰老大鼠模型，通過檢測胸腺及脾臟退行性的病理改變及脾臟自由基水平的改變，結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行綜合評價，探討中藥淫羊藿和女貞子單用及配伍對免疫器官衰老的影響作用的差異[7]。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級3月齡(8只)、6月齡組(8只)、8月齡(56只)健康雄性SD大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)股份有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0006，動物倫理學(xué)號：AEEI-2016-178。

2.試劑：總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒 (貨號：A015-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)測定試劑盒(貨號：A013-2)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒 (貨號：A003-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒 (貨號：A001-3)均購于南京建成生物工程研究所。

3.實驗儀器：電動勻漿機(上海精密儀器儀表有限公司)；SpectraMax Plus 385全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；全自動生化儀(日本奧林巴斯株式會社，型號：AU480)；尼康(日本Nikon公司)ECLIPSE 80i 生物顯微鏡及NIS-Elements BR 3.2 圖像分析軟件(北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司)。

4.藥材及煎煮方法：中藥飲片炙淫羊藿(批號：23820701，產(chǎn)地：陜西)及酒女貞子(批號：170517003，產(chǎn)地：甘肅)購于北京同仁堂藥店，由北京美康唐醫(yī)藥科技有限公司炮制加工。分別稱取適量的淫羊藿飲片、女貞子飲片、淫羊藿女貞子飲片配伍(4∶3)制備淫羊藿煎劑、女貞子煎劑及淫羊藿女貞子煎劑。首煎加8倍體積的水浸泡1h后加熱煮沸，文火保持沸騰30min，攪拌，趁熱濾取藥液；藥渣再加原藥量6倍的水加熱煮沸，改文火續(xù)煎30min后過濾，合并兩次藥液，濃縮后4℃保存。

5.分組及給藥:8月齡大鼠隨機分為7組，包括9月齡組、12月齡組、15月齡組、17月齡組、淫羊藿女貞子組(配伍組)、淫羊藿組、女貞子組，每組8只。SPF級3月齡(8只)、6月齡(8只)作為青年對照組。17月齡組、淫羊藿組、女貞子組、配伍組正常飼養(yǎng)至15月齡后分別給予等體積的蒸餾水、淫羊藿煎劑0.20g/ml、女貞子煎劑0.15g/ml、淫羊藿女貞子煎劑0.35g/ml體重(相當(dāng)于臨床等效劑量)灌胃，連續(xù)2個月。

6.處死及取材：3、6月齡組大鼠購買后適應(yīng)環(huán)境1周后處死；9、12、15、17月齡組飼養(yǎng)至相應(yīng)月齡后處死；各給藥組飼養(yǎng)至17月齡后處死。禁食16h后，稱重。腹腔注射烏拉坦麻醉后，剖取脾臟、胸腺。稱重后，切除一部分放入10%甲醛固定；其余迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

7.檢測方法：臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體質(zhì)量(g)。每組取7只樣本，行組織HE染色切片，每張切片在200倍鏡下選取3個不同的視野進行測量病理學(xué)參數(shù)，計算平均值。脾組織病理學(xué)參數(shù)：參考文獻(xiàn)[8]測量脾小體直徑。胸腺的病理學(xué)參數(shù)：參考文獻(xiàn)[9]測量皮質(zhì)/總面積、髓質(zhì)/總面積。制備脾臟勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)法測定勻漿上清中蛋白含量；微板法測定勻漿中NO測水平；比色法測定T-AOC水平；WST-1法測定SOD測水平；TBA法測定MDA水平。以上檢測均按照測試盒說明書進行。

結(jié) 果

1.大鼠脾臟指數(shù)及病理的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響：與3月齡組比較，12、15、17月齡組脾臟重量顯著升高(P均<0.01)，9、12、15、17月齡組脾臟指數(shù)顯著降低(P均<0.01)，各組脾小體直徑顯著降低(P<0.05或0.01)。與6月齡組比較，15、17月齡組脾臟指數(shù)及脾小體直徑顯著降低(P均<0.01)。與17月齡衰老大鼠比較，淫羊藿組、女貞子組和配伍組脾小體直徑均顯著增加(P均<0.01，表1,表2，圖1)。

表1 不同月齡組大鼠脾臟指數(shù)及脾小體直徑的比較

與3月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01；與6月齡組比較，△P<0.01；與9月齡組比較，#P<0.01；與12月齡組比較，▲P<0.05；脾臟重量及指數(shù)：n=8；脾小體直徑：n=7

表2 淫羊藿女貞子對衰老大鼠脾臟指數(shù)及脾小體直徑的影響

與17月齡組比較，*P<0.01。脾臟重量及指數(shù)：n=8；脾小體直徑：n=7

2.大鼠脾臟T-AOC、SOD、MDA及NO的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響：不同年齡組大鼠脾臟T-AOC、SOD、NO水平在6月齡組達(dá)到峰值，之后隨著月齡的增加而逐漸降低；而脾臟MDA水平在6月齡最低，之后隨著月齡的增加而逐漸升高(P均<0.01)。與17月齡老年大鼠比較，各用藥組大鼠脾臟SOD水平均顯著升高(P均<0.01)；且配伍組的作用優(yōu)于淫羊藿單用組(P<0.05，表3，表4)。

圖1 各組大鼠脾臟病理HE染色照片(×200)A.3月齡組；B.6月齡組；C.9月齡組；D.12月齡組；E.15月齡組；F.17月齡組；G.淫羊藿組；H.女貞子組；I.配伍組

表3 不同月齡組大鼠脾臟T-AOC、SOD、MDA及NO的比較

與3月齡組比較，*P<0.01；與6月齡組比較，△P<0.01；與9月齡組比較，#P<0.01；與12月齡組比較，○P<0.01；與15月齡組比較，▲P<0.01

表4 淫羊藿女貞子對衰老大鼠脾臟T-AOC、SOD、MDA及NO的影響

與17月齡組比較，*P<0.01；與配伍組比較，#P<0.05

3.大鼠胸腺指數(shù)及病理的增齡性改變及淫羊藿和女貞子的影響：與3月齡組比較，其余各月齡組胸腺指數(shù)均顯著降低(P<0.01)，除15月齡組外各組胸腺重量顯著降低(P<0.05)；12、15、17月齡組胸腺病理參數(shù)，包括皮質(zhì)、髓質(zhì)與面積比值，與3、6、9月齡組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；17月齡組胸腺病理參數(shù)與12月齡組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，與17月齡組衰老大鼠比較，淫羊藿和配伍組能顯著升高胸腺指數(shù)(P<0.01)，但僅配伍組對胸腺的病理參數(shù)有顯著改善作用(P均<0.05，表5，表6，圖2)。

表5 不同月齡組大鼠胸腺指數(shù)及病理參數(shù)的比較

與3月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01；與6月齡組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與9月齡組比較，#P<0.01；與12月齡組比較，○P<0.05；胸腺重量及指數(shù)：n=8；胸腺病理參數(shù)(皮質(zhì)/總面積、髓質(zhì)/總面積)：n=7

表6 淫羊藿女貞子對衰老大鼠胸腺指數(shù)及病理參數(shù)的影響

與17月齡組比較，*P<0.05，**P<0.01。胸腺重及胸腺臟指數(shù)：n=8；胸腺病理參數(shù)(皮質(zhì)/總面積、髓質(zhì)/總面積)：n=7

圖2 各組大鼠胸腺病理HE染色照片(×200)A.3月齡組；B.6月齡組；C.9月齡組；D.12月齡組；E.15月齡組；F.17月齡組；G.淫羊藿組；H.女貞子組；I.配伍組

4.基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型評價淫羊藿女貞子對衰老大鼠脾臟和胸腺的綜合作用：對6個不同月齡組的12項檢測指標(biāo)應(yīng)用多層感知(multi-layer perceptron，MLP)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，其中訓(xùn)練樣本39，測試樣本9個，得到的模型訓(xùn)練樣本相對錯誤預(yù)測5%，測試樣本相對錯誤預(yù)測5.7%。利用此模型對給藥各組樣本的12項數(shù)據(jù)進行年齡預(yù)測，得到配伍組預(yù)測年齡為14.25±0.54個月，與17月齡組的預(yù)測值16.39±0.21個月比較有顯著降低(P<0.01)；與淫羊藿組、女貞子單用組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)輸入指標(biāo)對網(wǎng)絡(luò)的影響程度，可知胸腺指數(shù)、脾臟SOD、脾小體直徑、脾臟指數(shù)、脾臟T-AOC是本神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中更為重要的影響因素(表9，圖3)。

表9 基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對給藥各組的年齡預(yù)測

與17月齡組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖3 MLP輸入變量重要性分析

討 論

祖國醫(yī)學(xué)則認(rèn)為五臟皆虛是衰老之本，認(rèn)為臟腑虛衰是導(dǎo)致人體衰老、死亡的原因，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)衰老過程中人體器官組織的增齡性退行性損變相符[10]。在中醫(yī)學(xué)對于衰老的認(rèn)識的諸多學(xué)說中，腎虛衰老學(xué)說一直占主導(dǎo)地位。中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，主藏精；腎精通過腎陽蒸化腎陰產(chǎn)生腎氣，而腎氣則直接關(guān)系到人體的生長、發(fā)育、生殖和衰老[11]。故腎中精氣不足，腎虛漸虧是衰老的核心及根本原因，且始終貫穿于整個衰老過程[12]?；谏鲜瞿I虛與衰老的聯(lián)系，中醫(yī)藥抗衰老的治療歷來強調(diào)補腎方藥的應(yīng)用。淫羊藿、女貞子作為常用的延緩衰老的補腎中藥，淫羊藿具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，研究表明其具有延緩衰老的作用，與抗氧化、降脂、調(diào)節(jié)免疫、改善學(xué)習(xí)記憶能力，提高心血管功能及生殖功能等有關(guān)[5，13]。女貞子具有滋補肝腎、明目烏發(fā)的功效，研究表明其具有的延緩衰老的作用，與抗氧化、護肝、抗炎、降脂、調(diào)節(jié)免疫、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用有關(guān)[14,15]。淫羊藿女貞子配伍可平補腎中陰陽，是國家級名老中醫(yī)李世增教授常用于治療衰老相關(guān)疾病的基本藥對組合。李世增教授臨床上遵張景岳“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”的配伍指導(dǎo)，在補腎藥中篩選淫羊藿、女貞子二藥配伍“平補陰陽、補腎益精”，隨癥加減組方，用于腎陰虛、腎陽虛及腎精不足、陰陽兩虛等證取得較好的療效。

免疫衰老是免疫系統(tǒng)全方位多系統(tǒng)的并由基因嚴(yán)格控制的循序漸進的自然過程，表現(xiàn)為隨著年齡的増加免疫系統(tǒng)進行性損傷，對感染的控制能力降低，且免疫衰老的始因在于增齡導(dǎo)致胸腺的萎縮[16]。本研究證實，3月齡青年大鼠胸腺指數(shù)及胸腺皮質(zhì)占比最高，之后隨著老年大鼠月齡的增加，胸腺重量及指數(shù)均顯著降低，胸腺萎縮，胸腺皮質(zhì)占比顯著降低，胸腺皮質(zhì)厚度逐漸變薄，說明不成熟前體T細(xì)胞隨年齡增長逐漸減少，與報道結(jié)果相符[2]。筆者同時觀察到自然衰老大鼠脾組織也出現(xiàn)退行性的病理改變，脾臟中脾小體的直徑隨年齡增加而降低，提示脾臟免疫功能降低；同時脾組織中SOD、T-AOC及NO水平顯著降低，且MDA水平顯著升高，提示脾臟中自由基水平隨年齡增大而增加，抗氧化能力降低，脾臟退行性的病理改變與自由基損傷有關(guān)，與文獻(xiàn)報道一致[2]。基于中藥淫羊藿、女貞子單用及配伍使用后，均能增加衰老大鼠脾小體直徑，升高脾臟SOD水平；淫羊藿及配伍組增加胸腺指數(shù)，僅配伍組可顯著改善胸腺的病理參數(shù)，提示二藥配伍有對免疫器官胸腺及脾臟的退行性的病理改變具有較好的改善作用。

綜上所述，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型綜合評價了淫羊藿、女貞子單用及配伍的作用，證實淫羊藿、女貞子單用及配伍對衰老大鼠胸腺及脾臟均有顯著改善作用(P<0.05)，但單用及配伍組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因淫羊藿、女貞子對脾臟T-AOC無顯著改善作用，提示二藥影響脾臟的退行性改變的作用可能與抗氧化作用關(guān)系并不密切，可能通過其他的途徑，尚有待于進一步研究。