藥代動力學實驗室液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀期間核查方法的建立

金冠欽，孫黎，王玉洪，夏玲紅，林厚文

（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院藥學部，上海 200127）

隨著檢測技術(shù)的迅速發(fā)展，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC–MS／MS)以其分析時間迅速、分離能力強、操作相對便捷的優(yōu)勢在國內(nèi)外藥代動力學實驗室中備受青睞。然而，使用者雖能準確熟練操作，但對于如何自行對液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行性能考察，以驗證其檢測結(jié)果的質(zhì)量，尚無統(tǒng)一、系統(tǒng)的方法可供參考。2010 年，福建省率先出臺首部《JJF( 閩)1032–2010 液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀校準規(guī)范》［1］，首次細化液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀的校準要求，并形成規(guī)定；2011年，頒布了全國性校準規(guī)范指導文件《JJF1317–2011 液 相 色 譜– 質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀 校 準 規(guī) 范》［2］， 明確了液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀進行性能考察的參數(shù)指標，為其開展期間核查奠定了基礎(chǔ)。

作為國內(nèi)較早通過ISO／IEC 17025 認可的實驗室，上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院臨床藥理實驗室自2010 年起運行體系，分別從質(zhì)量手冊、程序文件以及標準操作規(guī)程三個層次對實驗室儀器進行有效管理。新版指導性文件CNAS CL–01: 2018對儀器設(shè)備的期間核查內(nèi)容進行了更新，其中6.4.4和6.4.10 條款對設(shè)備的驗證和核查提出了明確要 求［3］。開展期間核查的目的是為了保證設(shè)備的可信度，在兩次的檢定或校準期間，驗證儀器的運行狀態(tài)，確定其狀態(tài)的保持情況，防止因儀器設(shè)備出現(xiàn)意外偏離而影響檢測結(jié)果的準確性［4］。LC–MS／MS既是藥物濃度檢測最重要且常用的工具，也是準確度要求較高的關(guān)鍵設(shè)備［5］。液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀作為CNAS 資質(zhì)認定的檢測能力要求之一，對其狀態(tài)考察更是實驗室儀器管理的重中之重［6］。本實驗室制定相關(guān)標準操作規(guī)程，結(jié)合國內(nèi)外經(jīng)驗［7–8］，從狀態(tài)及性能核查、儀器比對、全國實驗室間質(zhì)評等多角度，建立對液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀的期間核查方法，以確保其檢測結(jié)果的有效性及準確性。筆者以API 3200 QTrap 三重四級桿液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀為例，詳細介紹其期間核查的方法。

1 實驗方法

實驗室根據(jù)儀器檢定規(guī)程、廠家提供的使用說明及國家計量檢定規(guī)范，并結(jié)合自身的實際情況，制定了針對液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀期間核查的標準操作規(guī)程。期間核查包括：狀態(tài)及性能核查、儀器比對、室間質(zhì)評三方面。

1.1 狀態(tài)及性能核查

狀態(tài)及性能核查使用公式(1)～(5)。

式中：SS——泵流量準確性，%；

SR——泵流量穩(wěn)定性，%；

Fs——流量設(shè)定值，mL／min；

Fmax——同一設(shè)定流量3 次測量值的最大值， mL／min；

Fmin——同一設(shè)定流量3 次測量值的最小值， mL／min；

Fm——流量實測值，mL／min；

w2——容量瓶與流動相的質(zhì)量之和，g；

w1——容量瓶的質(zhì)量，g；

ρt——實驗溫度下流動相的密度，g／cm3；

t——收集流動相的時間，min。

式中：ΔM——質(zhì)量準確性，u；

Mia——第i 個離子的測量值，u；

Mib——第i 個離子的理論值，u。

式中：RSD——測定結(jié)果的相對標準偏差；%；

xi——第i 次測量保留時間(min)或色譜峰面積；

i——測量序號。

1.1.1 泵流量穩(wěn)定性(SR)及泵流量準確性(SS)

液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀由高效液相色譜儀及三重四級桿質(zhì)譜儀串聯(lián)組成，高效液相色譜儀的流量對于樣品出峰時間，峰型以及峰面積均有影響。由于該高效液相色譜儀與質(zhì)譜配套使用，液相部分常規(guī)的流量設(shè)置均小于1 mL／min，故只需考察0.5 mL／min 及1 mL／min 兩個流量點，取消對大于1 mL／min 流量的核查。在測試開始前連接輸液系統(tǒng)、進樣器，流動相為純化水，打開閥門，于廢液出口用10 mL 容量瓶(容量瓶已稱定空瓶重量，且經(jīng)華東國家計量測試中心檢定合格)收集流動相。用秒表計時，其中0.5 mL／min 流量的收集時間為10 min，1.0 mL／min 流量的收集時間為5 min，收集結(jié)束后于經(jīng)檢定合格的電子天平上稱定重量，每個流量分別重復測量3 次。測定過程中用經(jīng)檢定的溫度計對水溫進行實時測定，以計算純化水重量。按公式(3)計算流量實測值Fm，按公式(1)和公式(2)計算SS和SR。要求流量為0.5 mL／min 的泵流量設(shè)定值誤差不大于5%，泵流量準確性誤差不大于3%；流量為1.0 mL／min 的泵流量設(shè)定值誤差不大于3%，泵流量準確性誤差不大于2%。

1.1.2 質(zhì)量范圍、質(zhì)量數(shù)準確性、分辨力

(1) 依 據(jù)《JJF1317–2011 液 相 色 譜– 質(zhì) 譜 聯(lián)用儀校準規(guī)范》中關(guān)于標準物質(zhì)或試劑的要求，實驗選擇聚醚多元醇（PPG）作為儀器調(diào)諧液，利用PPG425，PPG1000，PPG2000 混合溶液對質(zhì)量數(shù)應用范圍大于1 000 的質(zhì)譜儀進行校準調(diào)諧。實驗室常用的電離模式為ESI 模式，故期間核查針對ESI正離子及負離子進行考察。正離子模式下，分別于Q1 及Q3 采 用59.050，175.133，616.464，906.673，1 254.925，1 545.134 六個離子進行測試；負離子模式 下 則 采 用44.998，585.385，933.636，1 223.845，1 572.097 進行測試，根據(jù)測試結(jié)果記錄可使用的質(zhì)量范圍。

(2)質(zhì)量準確性判定時，將PPG 混合液直接針泵注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀離子源，分別使用上述離子理論值±5 的范圍進行掃描，根據(jù)公式(4)計算ΔM，以ΔM 的最大值作為質(zhì)量準確性的結(jié)果，要求液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的質(zhì)量準確性ΔM ≤0.5 u。

(3)分辨力測試需等待儀器運行穩(wěn)定后，仍使用針泵將PPG 混合液注入離子源，直接考察6 個離子的半峰寬(W1／2)，作為分辨力的結(jié)果。要求本實驗室液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的分辨力不大于1 u。

以上三個參數(shù)均可通過PPG 混合液進行測試。在測試過程中，分辨力可通過改變offset 值進行調(diào)整，整體響應值的大小可通過改變IE 值調(diào)整。當各參數(shù)調(diào)整至滿意結(jié)果后，則更新數(shù)據(jù)完成儀器的自校準。正、負離子模式下PPG 溶液全掃描10 次疊加質(zhì)譜圖見圖1。

1.1.3 信噪比

在ESI 正離子模式下，使用50 pg／μL 利血平標準溶液，經(jīng)WATERS XBridge C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，觀察色譜圖，記錄色譜峰高Hs以及信號峰后1～3 min的基線輸出信號Hn，并計算信噪比S／N，連續(xù)測量6次，以6 次測量S／N 的平均值作為信噪比結(jié)果。要求信噪比不小于50∶1；ESI 負離子模式下，采用100 pg／μL 氯霉素標準液，按上述方法測定信噪比，要求信噪比不小于20∶1。

1.1.4 色譜峰面積重復性與保留時間重復性

在ESI 正 離 子 模 式 下，使 用50 pg／μL 利血平標準液，經(jīng)WATERS XBridge C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)注入1 μL 進入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄其色譜峰面積和保留時間，連續(xù)測量6 次。由公式(5)分別計算色譜峰面積與保留時間的相對標準偏差(RSD)，作為色譜峰面積重復性與保留時間重復性的結(jié)果。ESI 負離子模式下，采用100 pg／uL 氯霉素標準液，按上述操作方法測定。要求ESI 正負離子模式下的色譜峰面積重復性RSD ≤6%，保留時間重復性RSD ≤2%。正、負離子模式下，利血平(m／z=609.3 →195.1)及氯霉素(m／z=321.0 →152.0)的典型色譜圖見圖2。

圖1 PPG 溶液全掃描質(zhì)譜圖

圖2 利血平及氯霉素典型色譜圖

1.2 儀器比對

儀器比對是與相同準確度等級的另一個儀器的量值進行比較，利用比較結(jié)果完成核查［9］。通過對實驗室各儀器間的相互比對，可考察同一待測物在不同儀器下測試結(jié)果的準確性及可靠性［10］。

1.2.1 比對儀器

儀器1：API 3200Trap 型串聯(lián)四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)，島津LC–20ADXR 色譜系統(tǒng)；

儀器2：API 4000 型串聯(lián)四級桿質(zhì)譜系統(tǒng)，島津LC–20ADXR 色譜系統(tǒng)。

1.2.2 藥品

氧氟沙星對照品：純度為99.7%，批號為130454–201206，中國食品藥品檢定研究院；

內(nèi)標物環(huán)丙沙星對照品：純度為99.8%，批號為130451–201203，中國食品藥品檢定研究院。

1.2.3 測試條件、樣品處理與溶液配制

(1)色譜條件。色譜柱：Waters BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相比例：甲醇–0.5%甲酸水(體積比為20∶80)。

(2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源(ESI)；正離子多反應監(jiān)測(MRM)；離子噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：600℃；去簇電壓：50 V；碰撞電壓：20 V；氧氟沙星、環(huán)丙沙星離子反應對分別為m／z 362.1 →m／z318.0，m／z 332.4 →m／z 288.2。

(3)血漿樣品處理。精密吸取100 μL 血漿，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的PEEK 管中，再加入300 μL 含內(nèi)標環(huán)丙沙星濃度為100 ng／mL 的甲醇溶液，置于渦旋振蕩器上振蕩1 min，15 000 r／min 離心得沉淀蛋白，取100 μL 上清液轉(zhuǎn)移至另一PEEK 管內(nèi)，再加入300 μL 含0.5%甲酸的水溶液，渦旋混勻1 min后轉(zhuǎn)移至自動進樣小瓶待測。

(4)溶液配制。①體外標準溶液的制備：精密稱取氧氟沙星標準品18.60 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，得741.8 μg／mL 的標準液作為儲備液，然后用甲醇稀釋得1，2，4，10，20，40，100 μg／mL 體外系列標準工作溶液。②體內(nèi)標準溶液的制備：分別取上述體外系列標準工作溶液各10 μL，分別加入空白血漿190 μL，得到50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 ng／mL 的體內(nèi)系列標準工作溶液，再按1.2.3(3)方法處理即得。

1.3 實驗室間質(zhì)評

實驗室間質(zhì)評作為保證檢測準確可靠的必要手段［11］，已成為國內(nèi)外衡量ISO17025 認可實驗室檢測能力的風向標［12–13］。本實驗室自2015 年始，至今已參加4 次由國家臨床檢驗中心發(fā)起的全國藥代動力學實驗室間質(zhì)評活動(計劃編碼：NCCL–PH–01)，成績?nèi)繛椤皾M意”。HPLC–MS／MS 法測定人血漿卡馬西平的濃度系成熟穩(wěn)定的測定方 法［14–15］，適合作為室間質(zhì)評方法對儀器進行考察。實驗室將全國室間質(zhì)評納入儀器檢測結(jié)果質(zhì)量保證體系中，以期從實際出發(fā)，對液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的性能進行評價。

1.3.1 藥品

卡馬西平對照品：純度為99.7%，批號為100142–201105，中國食品藥品檢定研究院；

內(nèi)標物(IS)卡馬西平–D10 對照品：純度為100%，批號為FN06241603，美國西格瑪奧德里奇公司。

1.3.2 測試條件、樣品處理與溶液配制

(1)色譜條件。色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（3.5μm，2.1×100 mm）；保護柱：Waters XBridgeTMC18柱（3.5μm，4.6×20 mm）；流動相：0.2%甲酸水溶液–乙腈；流量：0.4 mL／min；梯度洗脫：0.10 min 為0.2%甲酸水溶液–乙腈(90∶10)，0.40 min為0.2%甲酸水溶液–乙腈(5∶95)，3.00 min 為0.2%甲酸水溶液–乙腈(5∶95)，3.30 min 為0.2%甲酸水溶液–乙腈(90∶10)，4.00 min 停止。

(2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應監(jiān)測(MRM)，離子噴射電壓：5 000 V，離子源溫度：650℃；去簇電壓：66 V；碰撞電壓：25 V；卡馬西平及內(nèi)標離子反應對分別為m／z 237.2 →m／

z 194.2，m／z 247.2 →m／z 204.2。

(3)血漿樣品處理。取血漿40 μL 置于2 mL的PEEK 管中，加入乙腈溶液(含內(nèi)標物卡馬西平–D10 濃度為10 ng／mL)360 μL，用渦旋混合器振蕩3 min，混勻后于13 000 r／min、15℃下離心5 min，取上清液40 μL 加入至360 μL 的10%乙腈水溶液中，渦旋振蕩1 min，再于13 000 r／min、15℃離心5 min，取上清液300 μL轉(zhuǎn)移至進樣瓶中待測。

(4)溶液配制。①體外標準溶液的制備：精密稱取卡馬西平標準品20.66 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，得205.98 μg／mL 的卡馬西平標準液作為儲備液，取3 mL 儲備液用50%甲醇水溶液稀釋至50 mL，得12.359 μg／mL 卡馬西平標準液，并逐級對半稀釋，得6.179，3.09，1.545，0.772，0.386 μg／mL體外系列標準工作溶液。②體內(nèi)標準溶液的制備：分別取上述體外系列標準工作溶液各40 μL，分別加入空白血漿360 μL，得到38.6，77.2，154.5，309，617.9，1235.9 ng／mL 的體內(nèi)系列標準工作溶液，再按上述“1.3.2(3)”方法處理即得。

正離子模式下，卡馬西平（m/z=237. 2 →194. 2）及內(nèi)標物卡馬西平–D10（m/z=247. 2 →204. 2）的典型色譜圖見圖3、圖4。

圖3 卡馬西平色譜圖(m／z=237.2 →194.2)

圖4 卡馬西平–D10 色譜圖(m／z=247.2 →204.2)

2 結(jié)果與討論

2.1 狀態(tài)及性能核查結(jié)果

通過對API3200 QTrap 的各技術(shù)指標的核查，結(jié)果均合格，故2019 年度液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀狀態(tài)及性能核查通過，結(jié)果詳見表2 及表3。

表2 2019 年度液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀狀態(tài)及性能核查結(jié)果(質(zhì)譜)

表3 2019 年度液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀狀態(tài)及性能核查結(jié)果(液相)

2.2 儀器比對結(jié)果

兩臺儀器分別測定同一個未知濃度氧氟沙星血漿樣品，測定10 次。統(tǒng)計方法依次采用格魯布斯(Grubbs)檢驗剔除離群數(shù)值、F 檢驗判斷兩組數(shù)據(jù)精密度有無差異、t 檢驗判斷兩組數(shù)據(jù)均值有無差異。只有在F 檢驗和t 檢驗都顯示兩組數(shù)據(jù)無差異后，才能認定通過比對證明出具的檢測結(jié)果準確、可靠，具有可比性。

結(jié)果表明，兩臺儀器的10 次檢測數(shù)據(jù)經(jīng)Grubbs檢驗后發(fā)現(xiàn)均無離群值需剔除，氧氟沙星的檢測濃度分別為(680.7±6.57) ng／mL 和(684.7±12.41) ng／mL，均值和方差經(jīng)t 檢驗和F 檢驗發(fā)現(xiàn)均無顯著性差異，且兩臺儀器的精密度RSD ＜2%(小于15%為合格)，且準確度分別為97.24%，97.81%(判定合格標準為85%～115%)，結(jié)果見表4。

表4 2019 年度儀器比對數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果 ng／mL

2.3 全國室間質(zhì)評結(jié)果

使用API 3200QTrap 對5 個盲樣進行檢測，樣品結(jié)果均為滿意，實驗室以滿分100 分通過2019 年度全國藥代動力學實驗室間質(zhì)評活動，結(jié)果見表5。

表5 2019 年度全國藥代動力學實驗室間質(zhì)評盲樣測試結(jié)果

3 結(jié)論

在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀期間核查的過程中，標準物質(zhì)、相關(guān)儀器量具的檢定校準情況、儀器日常維護等也是影響其準確度的重要因素。據(jù)此，實驗室采取一系列措施，確保儀器期間核查數(shù)據(jù)的準確性。

（1）實驗室對標準物質(zhì)實行有效管理，首選購買可溯源至SI 單位［16］的生產(chǎn)單位，到目前為止均購自中國食品藥品檢定研究院；實驗室制定標準物質(zhì)檔案，對每個標準物質(zhì)的購買時間、規(guī)格、數(shù)量、廠家、批號、保存條件等進行登記；每季度開展標準物質(zhì)期間核查，檢查標準物質(zhì)性狀、標簽及有效期限。

（2）ISO 17025 體系重視儀器設(shè)備的準確性和可溯源性［17–18］，故實驗室在年度校準操作規(guī)程的基礎(chǔ)上，每年制定計量溯源性計劃，對實驗室儀器開展校準工作，包括對液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用儀期間核查時測量影響較大的玻璃器皿，建立合適的校準周期，并安排由華東國家計量測試中心完成校準檢定。在經(jīng)過檢定校準后，判定其性能指標合格，貼標簽進行標識。

（3）實驗室專門制定《儀器設(shè)備的控制與管理程序》，以應對儀器的日常維護保養(yǎng)工作，對包括液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在內(nèi)的重要儀器的維護保養(yǎng)，均作出具體要求。實驗室每天兩次監(jiān)控檢測室溫濕度，檢測室常年保持25℃溫度和40%～70%濕度；每月更換液相色譜部分的濾頭浸泡液，流動相每3 日更新；每兩周定期檢查更換清洗管路用的50%異丙醇，每6 個月更換質(zhì)譜抽真空用的機械泵機油，使儀器保持合適的真空度；每2 個月清洗質(zhì)譜儀空氣過濾網(wǎng)；定期更換液相質(zhì)譜連接塑料管路，清洗噴針以及interface Q1，Curtain Plate，Orifice 等離子源部件，以防系統(tǒng)污染，影響檢測質(zhì)量。

本實驗室根據(jù)自身條件，結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的參考標準及相關(guān)規(guī)范，制定期間核查方法。本次期間核查由于檢測器材的限制，未對柱溫箱及色譜柱進行考察，今后將增加對柱溫箱溫度的準確度、以及使用不同色譜柱儀器的出峰情況等方面的核查。實驗室嚴格按照期間核查的結(jié)果對液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行判定，如果發(fā)現(xiàn)超出使用要求，均應立即停用，并對其進行隔離或加貼標簽清晰標明以防止誤用。對于發(fā)現(xiàn)的問題，依據(jù)CNAS 規(guī)定及時啟動不符合項工作程序的管理［19］。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀是靈敏度高的精密儀器，定期開展對關(guān)鍵性儀器設(shè)備期間核查活動，已成為ISO 17025 認可實驗室一項重要的日常工作之 一［20］。定期實施期間核查可顯著提高檢測質(zhì)量，降低檢測過程中差錯發(fā)生率，持續(xù)保持設(shè)備校準狀態(tài)的可信度［21］。