基于液相色譜原理的黃曲霉毒素測定儀校準(zhǔn)方法

楊宇，尚夢帆，賈會，馮帥博，李軍偉

（1.河南省計(jì)量科學(xué)研究院，鄭州 450008； 2.河南省花生及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南正陽 463600）

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由真菌寄生曲霉和黃曲霉菌等產(chǎn)生的次級代謝物［1］，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，具有高毒性和高致癌性。1993 年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I 類致癌物［2–4］。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素及其衍生物有20 多種，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種［5］，也是在天然食物中最為多見的一種，極易污染玉米、花生、食用植物油、飼料等；AFB1 是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，其毒性作用主要表現(xiàn)為對肝臟的損害，其毒性是氰化鉀的10 倍、砒霜的68 倍，因此世界各國均對食品中AFB1 含量作了非常嚴(yán)格的限定［6–9］。我國2015 版藥典規(guī)定大棗、決明子、麥芽、胖大海、蓮子等19 個品種必須檢測黃曲霉毒素；黃曲霉毒素B1 也是原國家質(zhì)檢總局規(guī)定大部分食品的必檢項(xiàng)目之一，因此對黃曲霉毒素類測定儀進(jìn)行定期校準(zhǔn)非常有必要。

黃曲霉毒素測定儀集成了液相色譜系統(tǒng)、柱后光化學(xué)衍生模塊、固定光路熒光檢測模塊(激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為440 nm)，其最小檢測濃度、線性范圍、重復(fù)性等指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法規(guī)要求［10］。其中熒光檢測模塊特點(diǎn)是選擇性、靈敏度高，而且僅對熒光物質(zhì)有響應(yīng)，適合于多環(huán)芳烴及各種熒光物質(zhì)的痕量分析；同時也可用于檢測不發(fā)熒光但經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后可發(fā)熒光的物質(zhì)。例如在酚類分析中，多數(shù)酚類不發(fā)熒光，為此先經(jīng)處理使其變?yōu)闊晒馕镔|(zhì)，而后進(jìn)行分析［11］。此類黃曲霉毒素測定儀現(xiàn)已在糧食、食品、飼料、藥材等相關(guān)領(lǐng)域有較為廣泛的應(yīng)用，并有不斷增長的趨勢。筆者選用ALC10 型黃曲霉毒素專用測定儀，具有一定的產(chǎn)品優(yōu)勢，如相對于配備衍生裝置和熒光檢測器的通用型液相色譜ALC10 具有更高的性價比；ALC10 內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用方法，采用一鍵式操作，在充分保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的前提下，操作簡單便捷，極大地提高了分析效率，AFB1 衍生后的熒光信號增強(qiáng)達(dá)30 倍以上，因此該儀器具有分析速度快、選擇性好、檢測靈敏度高等特點(diǎn)，能夠有效滿足其校準(zhǔn)通用技術(shù)要求以及各項(xiàng)試驗(yàn)需求。

目前，AFB1 的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、薄層層析法等［12–13］，這些方法雖然具有檢出限低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［14］，但樣品處理過程復(fù)雜，檢測費(fèi)時且需要專業(yè)人員操作，而且針對該類黃曲霉毒素專用測定儀尚沒有相應(yīng)的國家和地方計(jì)量檢定規(guī)程或校準(zhǔn)規(guī)規(guī)范。我國作為農(nóng)業(yè)大國且食品工業(yè)相對發(fā)達(dá)，建立該校準(zhǔn)方法具有特別的必要性和迫切性。筆者參考GBT 36858–2018 《飼料中黃曲霉毒素B1 的測定 高效液相色譜法》［15］、JJG 705–2014 《液相色譜儀檢定規(guī)程》［16］以及儀器說明書，對黃曲霉毒素測定儀動態(tài)基線漂移及長期基線噪聲、線性相關(guān)系數(shù)、最小檢測濃度、定性定量重復(fù)性等主要計(jì)量項(xiàng)目和技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

黃曲霉毒素測定儀：ALC10 型，配有輸液泵、Working Station 數(shù)據(jù)庫版工作站，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；

甲醇中黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.96 μg／mL，擴(kuò)展不確定度為0.09 μg／mL(k=2)，編號為GBW(E) 100302，國家糧食局科學(xué)研究院；

甲醇、乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

數(shù)字溫度計(jì)：測量范圍為0～100℃，最大允許誤差為±0.3℃，合肥常宏測控技術(shù)有限責(zé)任公司；

分析天平：感量為0.1 mg，上海天平儀器廠；

秒表：最小分度值不大于0.1 s，上海秒表廠；

注射器：100 μL，1 mL和10 mL注射器各一支，北京玻璃儀器集團(tuán)公司；

容量瓶：10 mL 容量瓶若干，北京玻璃儀器集團(tuán)公司；

上述設(shè)備應(yīng)具備有效期內(nèi)的檢定證書。

1.2 環(huán)境條件

環(huán)境溫度為：15～30℃；相對濕度為：20%～80%；供壓電源：電壓為(220±22) V，頻率為(50±1) Hz；儀器應(yīng)平穩(wěn)地放在工作臺上，周圍應(yīng)無強(qiáng)烈機(jī)械震動，無強(qiáng)電磁場干擾，且儀器接地良好。

1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

用流動相為68%A 相（水）–32%B 相（體積比為1∶1 的乙腈–甲醇）稀釋甲醇中AFB1 標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成AFB1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,質(zhì)量濃度依次為0.1，0.5，2，5，10，20，40 ng／mL。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：40℃(溫差控制范圍為±2℃)；柱流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：50 μL 定量環(huán)滿環(huán)進(jìn)樣；時間常數(shù)：高；檢測波長：激發(fā)波長為360 nm，發(fā)射波長為440 nm；動態(tài)基線漂移及長期噪聲的基線測試用流動相為甲醇；其余校準(zhǔn)項(xiàng)目的流動相：A相為水，B相為乙腈–甲醇(體積比為1∶1)，等梯度洗脫：68%A–32%B。

1.5 校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法

1.5.1 通用技術(shù)要求

按照相關(guān)通用技術(shù)要求，對儀器標(biāo)牌上名稱、型號、制造廠名、出廠編號、生產(chǎn)日期、制造計(jì)量器具許可證計(jì)編號等內(nèi)容的標(biāo)識進(jìn)行逐項(xiàng)檢查。儀器外觀不應(yīng)存在妨礙正常工作的機(jī)械損傷；樣品池及液路無泄漏；儀器電源線、信號線等插接緊密，各開關(guān)、旋鈕、按鍵等功能正常；指示燈靈敏，顯示器清晰；儀器在不工作的狀態(tài)下，當(dāng)試驗(yàn)電壓為500 V 時，電源插頭的相線與儀器機(jī)殼外露金屬部分之間的絕緣電阻應(yīng)不小于20 MΩ。

1.5.2 動態(tài)基線漂移及長期基線噪聲

選用C18色譜柱，以100%甲醇為流動相，流量為1.0 mL／min，設(shè)置儀器參數(shù)后平衡系統(tǒng)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后開始記錄基線1 h。用1 h 內(nèi)基線偏離起始點(diǎn)最大響應(yīng)信號值(counts／h)作為該檢測器動態(tài)基線漂移，即以1 h 偏離起始點(diǎn)最大信號值與起始點(diǎn)之差作為該儀器的動態(tài)基線漂移值，如圖1 所示。

圖1 長期基線P–P 噪聲計(jì)算示意圖

在以上1 h 基線范圍內(nèi)選取所記錄基線中噪聲較大的30 min 作為計(jì)算長期噪聲的基線，使用30 min 范圍內(nèi)的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算出線性回歸方程。將給定時間范圍內(nèi)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)減去線性回歸線，獲得漂移修正信號。然后按式(1)計(jì)算動態(tài)長期峰到峰噪聲，即所選30 min 范圍漂移最大值與最小值之差作為該檢測器的長期基線噪聲值。(亦可參考通過色譜系統(tǒng)軟件直接計(jì)算P–P 噪聲)。

式中：Nd——長期基線噪聲；

Imax——選定的30 min 范圍內(nèi)漂移修正信號 的最高峰；

Imin——選定的30 min 范圍內(nèi)漂移修正信號 的最低峰。

1.5.3 線性相關(guān)系數(shù)

按1.4 色譜條件運(yùn)行，待壓力、基線穩(wěn)定后，利用手動進(jìn)樣的方式，用50 μL 定量環(huán)(滿環(huán)進(jìn)樣)由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣測定1.3 中配制的AFB1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄色譜圖。重復(fù)測量3次色譜峰面積，取算術(shù)平均值，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、以AFB1 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)r。

1.5.4 最小檢測濃度

最小檢測濃度是指檢測器恰能產(chǎn)生與噪聲相區(qū)別的響應(yīng)信號時所需的最小進(jìn)樣量，是表征儀器極限檢測能力的重要指標(biāo)，常用濃度(或質(zhì)量)表示。被測量儀器的最小檢測濃度則表示該儀器的檢測能力與極限，其值越小表明該儀器檢測能力越強(qiáng)。按1.4 色譜條件運(yùn)行，待壓力、基線穩(wěn)定后，用100 μL 微量注射器進(jìn)樣測定0.1 ng／mL 的AFB1 標(biāo)準(zhǔn)溶液，采集色譜圖，并記錄色譜圖中AFB1 的色譜峰高和基線噪聲峰高，按式(2)計(jì)算最小檢測濃度：

式中：cL——最小檢測濃度，ng／mL；

Nd——基線噪聲峰高；

c——AFB1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ng／mL；

V——進(jìn)樣體積，μL；

H——色譜圖中AFB1 的色譜峰高；

50——標(biāo)準(zhǔn)的定量進(jìn)樣體積，μL。

1.5.5 定性、定量重復(fù)性

按1.4 色譜條件運(yùn)行，待壓力、基線穩(wěn)定后，用100 μL 微量注射器進(jìn)樣測定2.0 ng／mL 的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄色譜圖，重復(fù)測量7 次。將色譜圖測試數(shù)據(jù)中的保留時間和峰面積分別代入公式(3)計(jì)算儀器的定性、定量重復(fù)性：

式中：RSD——測量重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，%；

Xi——保留時間(或峰面積)第i 次測得的測量結(jié)果；

X——保留時間(或峰面積)n 次測量結(jié)果的算術(shù)平均值；

n——測量次數(shù)，n=7。

2 結(jié)果與討論

以ALC10 型黃曲霉毒素專用測定儀為例，按上述校準(zhǔn)方法和校準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行校準(zhǔn)試驗(yàn)。

2.1 通用技術(shù)要求檢查

按照1.5.1 對儀器外觀等逐項(xiàng)進(jìn)行檢查，儀器符合通用技術(shù)要求中各項(xiàng)內(nèi)容。

2.2 動態(tài)基線漂移及長期基線噪聲

通常情況下儀器檢測器的基線穩(wěn)定性可由噪聲和漂移兩項(xiàng)指標(biāo)來判定，其中基線噪聲與檢測器本身性能、檢測器與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的機(jī)械噪聲或者電信號噪聲密切相關(guān)。儀器漂移一般是指由于測量儀器計(jì)量特性的變化引起的示值在一定時間內(nèi)的連續(xù)或者增量變化，而產(chǎn)生基線漂移的原因多是由于儀器受到溫度、壓力、濕度等變化所引起；或是由于儀器本身性能的不穩(wěn)定影響。故測量儀器在使用時應(yīng)采取預(yù)熱、預(yù)先放置一段時間等措施以減少漂移。按照1.5.2 進(jìn)行動態(tài)基線漂移及長期基線噪聲的測量，結(jié)果如圖2 所示。計(jì)算可得該黃曲霉毒素測定儀所選定30 min 范圍內(nèi)的基線噪聲為117 counts，其基線漂移為204 counts／h。

圖2 動態(tài)基線漂移及長期基線噪聲測量結(jié)果圖

2.3 線性相關(guān)系數(shù)

線性相關(guān)系數(shù)是影響儀器測量結(jié)果精密度與準(zhǔn)確度的重要因素，被測儀器的相關(guān)系數(shù)越接近于1，則說明兩個變量的相關(guān)性越強(qiáng)，即該儀器在線性范圍內(nèi)可得到更為準(zhǔn)確可靠的測量結(jié)果。按照1.5.3依次測定AFB1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，結(jié)果見表1。計(jì)算得其線性回歸方程為y=457 299x+205 354.442 69，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線試樣的測量結(jié)果

2.4 最小檢測濃度

按1.5.4 對該測定儀進(jìn)行最小檢測濃度測量并記錄其色譜圖，結(jié)果如圖3 所示。按式(2)計(jì)算得該測定儀檢測器的最小檢測濃度為0.005 ng／mL。

圖3 最小檢出濃度測量結(jié)果圖

2.5 定性、定量重復(fù)性

測量結(jié)果的重復(fù)性用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示［17］。測量重復(fù)性反映各種隨機(jī)因素對測量結(jié)果的影響，包括所用的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境條件、配套儀器等因素以及測量的重復(fù)性。儀器測量重復(fù)性一般包括定性重復(fù)性和定量重復(fù)性［18］。按1.5.5 對該測定儀的定性、定量重復(fù)性進(jìn)行試驗(yàn)，色譜保留時間及色譜峰面積測量值見表2，色譜圖如圖4 所示。按式(3)計(jì)算得該黃曲霉毒素測定儀的定性重復(fù)性(RSD)為0.6%，定量重復(fù)性(RSD)為1.5%。

圖4 定性定量重復(fù)性測量結(jié)果圖

表2 定性、定量重復(fù)性測量結(jié)果

校準(zhǔn)結(jié)果的表達(dá)應(yīng)按照J(rèn)JF 1071–2010 《國家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》技術(shù)規(guī)范要求［19］，包括標(biāo)題、被校單位的名稱和地址、校準(zhǔn)日期、校準(zhǔn)所用量標(biāo)準(zhǔn)的溯源性及有效性說明、校準(zhǔn)環(huán)境等。另外，為全面評估黃曲霉毒素測定儀的綜合性能，所有校準(zhǔn)項(xiàng)目及校準(zhǔn)結(jié)果均應(yīng)在校準(zhǔn)證書中有所反映。儀器的測量不確定度來源于所用的測量儀器或者測量系統(tǒng)引起的測量不確定度的分量，而針對該類測定儀校準(zhǔn)結(jié)果的總不確定度則選擇以黃曲霉毒素B1 最小檢測濃度的不確定度表示。

3 計(jì)量性能指標(biāo)要求

考慮廠家儀器的出廠參數(shù)，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及2019 年度定期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再結(jié)合廠家多次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，總結(jié)出黃曲霉毒素測定儀主要計(jì)量性能指標(biāo)，應(yīng)符合表3 要求，則黃曲霉毒素測定儀性能正常，且量值溯源準(zhǔn)確可靠［18］。

表3 主要計(jì)量性能指標(biāo)參考要求

5 結(jié)語

建立了黃曲霉毒素測定儀的校準(zhǔn)方法。利用甲醇中黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液對黃曲霉毒素測定儀進(jìn)行校準(zhǔn)的方法是可行的。綜合各方面因素，總結(jié)得到黃曲霉毒素測定儀的計(jì)量性能要求參考指標(biāo)。該校準(zhǔn)方法能夠?qū)υ擃悳y定儀的總體性能進(jìn)行有效評判，為此類儀器的量值溯源提供技術(shù)支持與方法保證。