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    LC–MS/MS 法測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1 的含量及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

    2020-06-03 06:26:28李樹師超郭宇姝
    化學(xué)分析計(jì)量 2020年3期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)標(biāo)皂苷人參

    李樹,師超,郭宇姝

    (解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科,北京 100048)

    人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分之一,具有多種藥理活性,如神經(jīng)保護(hù)作用、防護(hù)應(yīng)激損傷、抑制腫瘤細(xì)胞、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等[1–3]。以往研究已有關(guān)于使用高效液相色譜–紫外檢測(cè)(HPLC–UV)和液相色譜–質(zhì)譜(LC–MS)以及液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜(LC–MS/MS)技術(shù),測(cè)定服用人參皂苷混合物或含人參的中藥方劑(如參麥注射液和開心散)后GRb1成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為的報(bào)道[4–7]。但中藥成分復(fù)雜,組分間存在相互作用,會(huì)影響GRb1的代謝動(dòng)力學(xué)行為[8]。有人對(duì)服用GRb1單體后的代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究[9],但定量限較高,為20 ng/mL[10]??蛋驳龋?1]采用梯度洗脫,單個(gè)樣品的分析時(shí)間較長(zhǎng)。在上述報(bào)道中,樣品預(yù)處理均采用常規(guī)方法??紤]到代謝動(dòng)力學(xué)研究過(guò)程中,常規(guī)的樣品預(yù)處理手段在處理大量生物樣品時(shí)效率較低,而基于96 孔板的樣品預(yù)處理技術(shù)可以明顯提高樣品處理的效率和通量[12]。因此筆者應(yīng)用基于96 孔板的高效血漿樣品處理手段,采用LC–MS/MS 法測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的含量,方法快速、靈敏,將其應(yīng)用于大鼠口服人參皂苷Rb1后的代謝動(dòng)力學(xué)研究。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    液相色譜儀:Agilent 1260 型,美國(guó)安捷倫科技有限公司;

    三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀:6410 型,美國(guó)安捷倫科技有限公司;

    高速低溫離心機(jī):GTR16-2 型,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;

    96 孔板系統(tǒng):美國(guó)瓦里安公司;

    渦旋振蕩器:VORTEX 4 型,德國(guó)IKA 公司;電子分析天平:BT–25 S 型,感量為0.000 01 g,德國(guó)Sartourious 公司;

    超純水系統(tǒng):Milli-Q 型,美國(guó)密理博公司;

    人參皂苷Rb1對(duì)照品:純度為98%,批號(hào)為J1229008,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

    人參皂苷Rg1對(duì)照品:純度大于98%,批號(hào)為I1228039,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

    甲醇、乙腈、甲酸:色譜純,德國(guó)默克公司;

    SD 大鼠:體重270~320 g,雌雄各半,合格證號(hào):SCXK(京)2009–0007,北京華阜康生物科技股份有限公司;

    實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

    1.2 儀器工作譜條件

    1.2.1 色譜條件

    色譜柱:Agilent SB–C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);流動(dòng)相:甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25);流量:0.2 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL。

    1.2.2 質(zhì)譜條件

    采用電噴霧正離子模式;毛細(xì)管電壓:3.5 kV;干燥氣:N2,流量為11 L/min;干燥氣溫度:350℃;檢測(cè)離子對(duì):人參皂苷Rb1(m/z 1 131.5 →365.1),內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1(m/z 823.3 →643.4);碰撞電壓:60 eV(人參皂苷Rb1),40 eV(人參皂苷Rg1)。

    1.3 溶液配制

    精密稱取10.0 mg 人參皂苷Rb1,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至標(biāo)線,得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的人參皂苷Rb1儲(chǔ)備液。精密移取Rb1儲(chǔ)備液適量,配成20,40,100,300,1 000,3 000,10 000 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將人參皂苷Rb1的工作溶液,用空白血漿進(jìn)行稀釋得到人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為1,2,5,15,50,150,500 ng/mL 的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。質(zhì)控樣品依照相同的方法進(jìn)行稀釋配制,人參皂苷Rb1的質(zhì)量濃度分別為2,20,400 ng/mL。

    精密稱取10.0 mg 內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1,置于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容至標(biāo)線,得到1 mg/mL的人參皂苷Rg1儲(chǔ)備液,精密移取Rg1儲(chǔ)備液適量,配成200 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

    1.5 血漿樣品預(yù)處理

    血漿樣品的預(yù)處理在96 孔板上結(jié)合8 道移液器完成。將100 μL 系列血漿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白血漿樣品、質(zhì)控樣品等分別加入到96 孔板中,并加入內(nèi)標(biāo)工作溶液5 μL(空白血漿樣品除外),渦旋混合30 s 后,加入0.1 mol/L 的NaOH 溶液10 μL,渦旋混勻。在上述溶液中加入正丁醇0.5 mL,振搖提取2 min,在2 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min后,于–20℃冷凍1 h,移取上層有機(jī)溶劑0.4 mL 至另一板中,于45℃下用氮?dú)獯蹈?,?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶后進(jìn)樣分析。

    1.6 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

    6 只大鼠,雌雄各半,禁食過(guò)夜,灌胃給予5 mg/kg 的人參皂苷Rb1。于給藥前及給藥后0.25,0.5,0.75,1,2,3,4,6,8,10,12,24,36,48,72 h,眼眶取血約0.3 mL,置于肝素化的離心管中,離心分取血漿,于–20℃下保存。所得的血藥濃度–時(shí)間數(shù)據(jù)以非房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 液相色譜–質(zhì)譜條件優(yōu)化

    在液相色譜條件優(yōu)化過(guò)程中,綜合考慮分離度、色譜峰對(duì)稱性、保留時(shí)間等因素,圍繞流動(dòng)相組成及甲酸、乙酸等添加劑的種類及含量展開,最終確定以甲醇–0.1%甲酸溶液(體積比為75∶25)為流動(dòng)相。通過(guò)比較人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)在正、負(fù)兩種離子檢測(cè)方式下的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)兩種待測(cè)成分在正離子模式下的響應(yīng)明顯優(yōu)于負(fù)離子模式,因此選擇正離子模式。通過(guò)對(duì)人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)分子離子峰[M+Na]+分別為m/z 1 131.5 和 m/z 823.3。采用儀器自帶的Masshunter Optimizer (Version B.04.01)軟件進(jìn)行二級(jí)碎片的掃描和優(yōu)化,最終確定人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的定量離子反應(yīng)分別為1 131.5 →365.1,823.3 →643.4,最優(yōu)碰撞電壓分別為60,40 eV。圖1 為人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的一/二級(jí)質(zhì)譜圖。

    圖1 人參皂苷Rb1(A)和內(nèi)標(biāo)(B)的一/二級(jí)質(zhì)譜圖

    2.2 方法專屬性

    在選擇提取溶劑時(shí),對(duì)液–液萃取過(guò)程中有機(jī)溶劑的組分進(jìn)行考察。比較了正丁醇、乙酸乙酯以及二者不同比例混合液作為提取溶劑時(shí)對(duì)血漿樣品提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)正丁醇提取回收率高,基質(zhì)效應(yīng)少,因此最終采用正丁醇作為提取溶劑。將5 個(gè)不同個(gè)體的大鼠血漿及標(biāo)準(zhǔn)添加血漿按1.5 進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理,色譜圖見圖2。如圖2 所示,人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.8 min 和1.3 min,血漿中的內(nèi)源性成分不干擾目標(biāo)成分的出峰位置。

    圖2 大鼠血漿中的人參皂苷Rb1 和內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1 的色譜圖

    2.3 線性方程、線性范圍和定量限

    通過(guò)測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度點(diǎn),以人參皂苷Rb1與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(y)對(duì)濃度(x)進(jìn)行線性回歸,以1/x 為加權(quán)系數(shù)。測(cè)得人參皂苷Rb1的線性范圍為1~500 ng/mL,回歸方程為y=0.053 96x+0.004 045,r2=0.999 5,定量限為1 ng/mL。精密度為8.2%,準(zhǔn)確度為113.4%。對(duì)于濃度超出線性范圍的血漿樣品,用空白血漿進(jìn)行10 倍稀釋后并重新測(cè)定,對(duì)稀釋效應(yīng)進(jìn)行考查,發(fā)現(xiàn)10 倍稀釋后,對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性沒有影響。

    2.4 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

    通過(guò)測(cè)定低、中、高3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣品,計(jì)算大鼠血漿中人參皂苷Rb1的批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度,結(jié)果見表1。

    表1 批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

    提取回收率反映了生物樣品中目標(biāo)化合物的提取效率,是評(píng)價(jià)生物樣品分析方法的重要指標(biāo)之一[13]?;|(zhì)效應(yīng)是指在LC–MS/MS 分析測(cè)定中,色譜分離時(shí)共洗脫物可能影響目標(biāo)化合物的離子化效率,引起信號(hào)抑制或增強(qiáng)。生物樣品中存在大量?jī)?nèi)源性物質(zhì),因此在對(duì)生物樣品進(jìn)行LC–MS/MS分析測(cè)定時(shí),必須對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)地考察[14]。通常有兩種方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng):柱后灌流法[15]和標(biāo)準(zhǔn)添加法[16]。設(shè)置低、中、高3 個(gè)濃度考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高3 個(gè)濃度的大鼠血漿質(zhì)控樣品測(cè)得的色譜峰面積為M1;空白血漿樣品經(jīng)提取后加入對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的色譜峰面積為M2;對(duì)應(yīng)濃度純標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)得的色譜峰面積為M3;計(jì)算回收率為M1與M2的比值,基質(zhì)效應(yīng)為M2與M3的比值。結(jié)果表明,人參皂苷Rb1在低、中、高三個(gè)濃度的回收率分別為80.3%,81.0%,79.7%,基質(zhì)效應(yīng)為96.6%,99.3%,99.3%;內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg1的回收率為83.1%,基質(zhì)效應(yīng)為91.4%。證明該方法提取回收率良好,基質(zhì)干擾效應(yīng)小,符合生物樣品分析方法的要求。

    2.6 穩(wěn)定性

    穩(wěn)定性是指在確定條件下,一定時(shí)間內(nèi)待測(cè)物在給定基質(zhì)中的化學(xué)穩(wěn)定性。按照《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》(2014 年5 月頒布)和《中華人民共和國(guó)藥典》(2015 年版)附錄中生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則的規(guī)定,在方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中,需要對(duì)分析樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。穩(wěn)定性研究主要考察了低、中、高3 個(gè)濃度的QC 樣品在室溫25℃放置4 h、樣品經(jīng)預(yù)處理后置于自動(dòng)進(jìn)樣器8 h、–20℃冷凍條件放置30 天、以及3 次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性,結(jié)果如表2 所示。結(jié)果表明,大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1在不同條件下的穩(wěn)定性良好,符合生物樣品分析方法的要求。

    表2 大鼠血漿樣品中人參皂苷Rb1 在不同條件下的穩(wěn)定性

    2.7 大鼠灌胃人參皂苷Rb1 后的代謝動(dòng)力學(xué)研究

    大鼠單次灌胃給予5 mg/kg 的人參皂苷Rb1后的平均血藥濃度時(shí)間曲線見圖3。用DAS 2.0 軟件以非房室模型計(jì)算代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示,人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)血藥濃度的達(dá)峰時(shí)間tmax為1.53 h,半衰期t1/2為13.54 h,MRT 為26.22 h,AUC0~24為16 237.76 (ng·h)/mL。

    圖3 大鼠口服5 mg/kg 人參皂苷Rb1 后的血藥濃度–時(shí)間曲線

    3 結(jié)語(yǔ)

    應(yīng)用96 孔板系統(tǒng)對(duì)大鼠血漿中的人參皂苷Rb1進(jìn)行液液萃取,實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)處理,可以在一塊孔板上完成隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線,增加了樣品處理的平行性,提高了樣品處理效率;采用等度洗脫,單個(gè)樣品的分離時(shí)間為3 min。通過(guò)對(duì)分析方法進(jìn)行優(yōu)化及系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證,最終確定定量下限為1 ng/mL。該方法具有快速、高效、靈敏等特點(diǎn),適用于人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)研究。

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