蓮草直胸跳甲Halloween基因家族鑒定及表達(dá)分析

劉亦然，張虹，靳繼蘇，周忠實(shí)，郭建英

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

0 引言

【研究意義】空心蓮子草（Alternanthera philoxeroides）為世界性惡性入侵雜草[1]，原產(chǎn)于南美洲，20世紀(jì)30年代傳入我國[2]，對我國農(nóng)林牧漁業(yè)產(chǎn)生了巨大危害[1,3-4]。蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）隸屬鞘翅目葉甲科，是空心蓮子草的專食性天敵，其幼蟲、成蟲取食空心蓮子草的葉片及嫩莖，控草效果較為顯著[5]。蛻皮激素（ecdysone）參與調(diào)控昆蟲中多種生命活動，如繁殖、滯育、先天免疫等[6-7]。Halloween基因家族是蛻皮激素合成通路中重要成員[8-10]，開展蓮草直胸跳甲Halloween家族基因研究，將有助于了解蛻皮激素對昆蟲的調(diào)控機(jī)制，為生防天敵的擴(kuò)繁提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】激素調(diào)節(jié)貫穿于昆蟲的整個生活史，昆蟲體內(nèi)的激素包括保幼激素、蛻皮激素和腦激素等；其中，蛻皮激素最早由BUTENANDT等于 1954年報道[11]，可參與調(diào)節(jié)昆蟲的蛻皮、變態(tài)、滯育和繁殖等生理過程[12]，具體包括調(diào)節(jié)昆蟲的細(xì)胞增殖、分化與凋亡、蛻皮及變態(tài)、神經(jīng)系統(tǒng)的重塑、滯育及免疫應(yīng)答等多項(xiàng)生命活動[13]。蛻皮激素的主要活性物質(zhì)為 20-羥基蛻皮酮（20E），其在昆蟲的幼蟲期由前胸腺產(chǎn)生，而在昆蟲羽化為成蟲后，其體內(nèi)的蛻皮激素由卵巢合成，參與卵巢的發(fā)育與繁殖[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在煙草天蛾（Manduca sexta）和黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲期蛻皮激素參與啟動幼蟲不同齡期之間的蛻皮及變態(tài)[15]；用 20E處理結(jié)扎的家蠶（Bombyx mori）雌蛹，血淋巴中卵黃原蛋白（Vg）含量明顯提高，卵巢的發(fā)育速度明顯加快[16]。在20E生物合成方面的突破性進(jìn)展是細(xì)胞色素 P450超家族編碼的Halloween基因家族的發(fā)現(xiàn)[17]。如已證實(shí)，在黑腹果蠅中 Halloween家族基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過一系

列生化反應(yīng)生成蛻皮激素；同時，當(dāng)CYP302A1被敲除后，黑腹果蠅出現(xiàn)蛻皮激素滴度降低的現(xiàn)象[18]。此外，在家蠶化蛹前對其 Halloween基因家族成員CYP314A1進(jìn)行干擾，出現(xiàn)家蠶不能正常化蛹以及雌蛾卵巢發(fā)育不正常的現(xiàn)象[19]。在植食性昆蟲中，Halloween基因家族主要包括CYP307（spook）、CYP306A1（phantom）、CYP302A1（disembodied）、CYP315A1（shadow）以及CYP314A1（shade）[20]；其中，CYP307、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1通過一系列的生化反應(yīng)參與合成無活性的蛻皮酮，最終由CYP314A1催化合成活性物質(zhì)20E[20-21]。但不同物種中其體內(nèi)Halloween基因家族存在一定差異，如瓦螨（Varroa destructor）和煙草天蛾中均只鑒別到3個 Halloween基因家族成員[22-23]。蓮草直胸跳甲作為空心蓮子草的生防天敵，我國于1987年從美國佛羅里達(dá)州引進(jìn)該跳甲并在江蘇、云南、四川和湖南等地釋放[24]。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該跳甲成蟲和幼蟲的蟲口密度越大，其控草速度越快，控草效果越顯著[25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對于昆蟲細(xì)胞色素 P450基因的研究主要集中在其對農(nóng)藥的抗藥性以及對不利環(huán)境的抵抗等方面，迄今在蓮草直胸跳甲中未有關(guān)于 P450基因參與蛻皮激素合成通路的報道，對其蛻皮激素合成通路中Halloween基因家族的數(shù)量、表達(dá)模式等尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】田間調(diào)查表明，在我國湖南地區(qū)，蓮草直胸跳甲的種群密度呈季節(jié)性波動趨勢，夏季數(shù)量明顯減少[26]，這是環(huán)境因素對其卵孵化、幼蟲發(fā)育、蛹羽化和成蟲繁殖影響的綜合體現(xiàn)。由于蛻皮激素參與調(diào)節(jié)昆蟲的蛻皮、變態(tài)、滯育和繁殖等生理過程[14]，本研究分析參與蛻皮激素合成的Halloween基因家族在蓮草直胸跳甲中的表達(dá)模式，解析Halloween基因家族對蓮草直胸跳甲種群動態(tài)的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用 RNA干擾技術(shù)分析其基因功能打下基礎(chǔ)，進(jìn)而為探尋促增蓮草直胸跳甲種群數(shù)量的方法提供新思路，從而更好地對入侵雜草空心蓮子草進(jìn)行生物防治。

1 材料與方法

1.1 供試植物

空心蓮子草根莖于2018年6月采自福建省福州市福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所南通中試基地，攜帶至河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊科研中試基地溫室，在塑料盒（30 cm×30 cm×30 cm）中用營養(yǎng)土（黑土∶蛭石=1∶1）栽培，并采用扦插方式擴(kuò)大栽種規(guī)模。空心蓮子草莖稈達(dá)4—7節(jié)間長時用于試驗(yàn)。

1.2 供試?yán)ハx

蓮草直胸跳甲成蟲于2018年10月采自湖南省長沙市湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院附近，攜帶至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊科研中試基地進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為75%±5%，光周期為12L∶12D，連續(xù)飼養(yǎng)3代后用于試驗(yàn)。

1.3 樣品采集

為測定Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)量，自產(chǎn)卵第1天起，每隔24 h逐日收集蓮草直胸跳甲各個時期的樣品，分別包括卵期第0—4天、幼蟲第1—13天、蛹期第1—7天和成蟲期第1—6、8、10天的雌蟲。上述各天數(shù)的樣品包括2—20個個體，3個生物學(xué)重復(fù)。

為測定Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同組織的表達(dá)量，將雌成蟲在1×PBS磷酸緩沖液（pH 7.4）中進(jìn)行解剖，分別取頭、胸、中腸、卵巢以及脂肪體，每份組織從5—15個個體中收集，3個生物學(xué)重復(fù)。

收集的所有樣品立即在液氮中冷凍，-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

利用Trizol法提取蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時期以及各組織的總 RNA。采用超微量紫外分光光度計Nanophoto meter P330（Implen，Germany）和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA的純度和完整性。參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，RNA定量為1 μg，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的片段的擴(kuò)增

將本實(shí)驗(yàn)室前期建立的蓮草直胸跳甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與NCBI庫進(jìn)行比對，得到蓮草直胸跳甲中共有6個Halloween基因家族成員，分別為CYP302A1、CYP306A1、CYP307A1、CYP307A2、CYP314A1、CYP315A1，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，Oligo軟件分析引物，并由上海生工生物工程公司合成所需引物。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用表1中特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）1 μL，Taq 酶 0.5 μL，cDNA 模板 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，連接至PEASTT3載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到陽性克隆后測序。

1.6 保守性分析與進(jìn)化分析

通過在線分析軟件Emboss Transeq將上述得到的核酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，后將其編碼的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測以及Blastp分析，分別找到與 Halloween家族基因具有同源性的昆蟲Halloween基因序列。使用MEGA6.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行1 000次重復(fù)計算后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測目的基因的表達(dá)水平

根據(jù)擴(kuò)增得到的目的基因設(shè)計特異性定量引物，同時選擇在蓮草直胸跳甲體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定的β-actin作為內(nèi)參基因（表2），并以上述提取的不同發(fā)育歷期、不同組織的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用qRT-PCR技術(shù)檢測蓮草直胸跳甲Halloween基因家族成員在不同組織以及不同發(fā)育階段的表達(dá)變化。選取TransStart Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量。擴(kuò)增體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)充 RNase-free water至 20 μL，擴(kuò)增程序采用兩步法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCT法對測定出的目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計算，計算公式：以該基因表達(dá)量最低的時期或組織作為對照，測定的基因表達(dá)量定為1。采用R version 3.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同一基因在不同日齡間的表達(dá)量差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法。

表1 用于克隆蓮草直胸跳甲中Halloween基因的完整或部分ORF引物Table 1 Complete or partial ORF primers for the cloning of the Halloween genes in A. hygrophila

表2 用于檢測蓮草直胸跳甲中Halloween基因表達(dá)水平所用引物Table 2 Primers used to detect the expression level of the Halloween genes in A. hygrophila

2 結(jié)果

2.1 Halloween基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖1 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族的結(jié)構(gòu)域Fig. 1 Domain architecture of A. hygrophila Halloween gene family

圖2 基于氨基酸序列構(gòu)建的Halloween基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹（鄰接法）Fig. 2 Phylogenetic tree of the Halloween gene family based on amino acid sequence (neighbor-joining)

基于前期得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并結(jié)合NCBI分析，在蓮草直胸跳甲中共鑒定得到6個Halloween基因家族成員，設(shè)計引物（表 1）擴(kuò)增得到其中間片段。為了明確蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族的進(jìn)化情況，分別進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖1、圖 2）。通過分析Halloween家族基因氨基酸序列可以看出其均屬于細(xì)胞色素P450超家族；AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜區(qū)域。由圖 2中可以看出，Halloween基因家族各基因可以分別與其他物種對應(yīng)的基因聚為一支，形成6個分支，表明蓮草直胸跳甲中 Halloween基因在漫長的進(jìn)化過程中符合P450超家族的特點(diǎn)，即具有一定的保守性；6個Halloween基因分開聚成6支，表明它們可能分別存在不同的進(jìn)化模式并各自具有不同的生物學(xué)功能。

2.2 Halloween基因家族時空表達(dá)分析

圖3 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族在不同發(fā)育時期的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression of the Halloween gene family at different developmental stages of A. hygrophila

2.2.1 不同時期 Halloween基因家族的表達(dá)分析由圖3可知，Halloween基因家族成員在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)量差異較大。其中，AhCYP302A1的mRNA表達(dá)量在1日齡卵期較高，蛹期第6、7天最高，在成蟲期急劇下降；AhCYP306A1的mRNA表達(dá)量呈波動趨勢，在幼蟲末齡及蛹前期表達(dá)量較高，其中以幼蟲第10天表達(dá)量最高，顯著高于其他時期的表達(dá)量；AhCYP307A1表達(dá)量在卵期第2、3天最高，之后呈波動下降趨勢，在成蟲期表達(dá)量趨于穩(wěn)定；AhCYP307A2表達(dá)量整體呈波動趨勢，其中以蛹期第2天表達(dá)量最高；AhCYP314A1在產(chǎn)卵初期的表達(dá)量顯著高于其他時期，在卵開始發(fā)育后的整個生活史中，AhCYP314A1的表達(dá)量整體呈先波動下降后波動上升的趨勢；AhCYP315A1在卵期第0天表達(dá)量最高，之后持續(xù)低表達(dá)直至雌蟲羽化第2天，在雌成蟲發(fā)育期間均高表達(dá)。

2.2.2 不同組織 Halloween基因家族的表達(dá)分析對Halloween基因家族6個基因在蓮草直胸跳甲雌成蟲頭、胸、中腸、卵巢、脂肪體 5種組織中表達(dá)量的檢測表明（圖4），Halloween基因家族成員在中腸中表達(dá)量均極低。AhCYP302A1在胸部表達(dá)量最高，其次為頭部和卵巢，但在這 3種組織中的表達(dá)量差異不顯著。AhCYP306A1在卵巢和脂肪體內(nèi)高表達(dá)，顯著高于在頭部和中腸的表達(dá)量。AhCYP307A1、AhCYP307A2分別在頭部和卵巢表達(dá)量極高，在其余組織中表達(dá)量均較低。AhCYP314A1在卵巢中表達(dá)量最高，其次為脂肪體，在頭部和中腸中表達(dá)量極低。AhCYP315A1在卵巢中表達(dá)量最高，在胸部和脂肪體中表達(dá)量相近，在中腸表達(dá)量最低，僅為在卵巢中表達(dá)量的千分之一。

3 討論

圖4 蓮草直胸跳甲Halloween基因家族在不同組織的相對表達(dá)量Fig. 4 Relative expression of the Halloween gene family in different tissues of A. hygrophila

蓮草直胸跳甲是入侵雜草空心蓮子草的專一性天敵，其成蟲和幼蟲均取食葉片，若在同一地點(diǎn)連續(xù)釋放 2—3年，空心蓮子草基本可得到控制[28]。目前，在我國湖南長沙等地空心蓮子草一年四季均大量發(fā)生，而蓮草直胸跳甲的種群動態(tài)卻呈波動趨勢。Halloween基因家族作為蛻皮激素合成通路中重要的一支，在昆蟲生長發(fā)育和繁殖中具有重要作用，因此會對昆蟲種群動態(tài)產(chǎn)生影響[29]。雖然已在多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)并鑒定Halloween家族基因，但目前尚無有關(guān)蓮草直胸跳甲中該基因家族的研究報道。

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得蓮草直胸跳甲蛻皮激素合成途徑Halloween家族6個基因AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1、AhCYP315A1的中間片段，其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2屬于細(xì)胞色素P450超家族中 CYP2集團(tuán)，AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1屬于線粒體集團(tuán)。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族具有一定的保守性，表明其在不同昆蟲中可能具有相似的功能；但在不同昆蟲中Halloween基因家族不同，有些酶在昆蟲進(jìn)化過程中已被消除、復(fù)制或發(fā)生改變；如CYP307家族中的spot在鱗翅目昆蟲以及果蠅科中不存在，但在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）中檢測到此基因[12]；此外，在蓮草直胸跳甲中發(fā)現(xiàn)的CYP307A2，在家蠶以及煙草天蛾中卻不存在[30]，表明蛻皮激素的合成路徑在不同昆蟲中存在物種特異性和進(jìn)化差異。

蛻皮激素可在昆蟲整個生活史中表達(dá)[31]。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定了Halloween基因在蓮草直胸跳甲不同蟲態(tài)和雌成蟲不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Halloween基因在蓮草直胸跳甲各蟲態(tài)均有表達(dá)，這與家蠶中的表達(dá)模式相似[19]，表明Halloween基因家族對蓮草直胸跳甲整個生活史均有影響。在蓮草直胸跳甲中AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A2在幼蟲以及蛹期表達(dá)量相對卵期、成蟲期較高，表明三者可能主要參與了蓮草直胸跳甲的蛻皮過程；其中，AhCYP306A1、AhCYP307A2在末齡幼蟲及化蛹初期的表達(dá)量顯著上調(diào)可能為其蛻皮與變態(tài)化蛹作準(zhǔn)備。AhCYP307A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在成蟲以及卵期表達(dá)量相對較高，三者可能主要與蓮草直胸跳甲的卵巢發(fā)育、卵發(fā)育等繁殖過程有關(guān)；AhCYP307A1在卵期第2、3天高表達(dá)以及AhCYP302A1在卵期第1天高表達(dá)的模式，推測其可能參與了蓮草直胸跳甲卵期的胚胎發(fā)育過程，這與黑腹果蠅中缺陷CYP302A1（Dib）以及CYP307A1（Spo）時胚胎發(fā)育不正常的現(xiàn)象相符[18]。蓮草直胸跳甲Halloween基因家族中的6個成員在同一發(fā)育時期、同一組織中表達(dá)存在差異，推測其可能在蓮草直胸跳甲中所行使的功能不同。如對白背飛虱（Sogatella furcifera）中若蟲Halloween基因時空表達(dá)分析表明，CYP307A1（Spo）在其2—4齡均有表達(dá)，其中在4齡以胸部表達(dá)量最高；給白背飛虱飼喂dsSpo后，若蟲發(fā)育顯著延遲，其中24%的若蟲停留在3齡[32]。在不同組織中，蓮草直胸跳甲中Halloween基因家族除AhCYP307A1外大多在卵巢中高表達(dá)，這與NIWA等報道的類固醇類激素參與調(diào)節(jié)蛻皮動物成蟲階段的生殖過程（如種系發(fā)育、先天發(fā)育等）[12]以及成蟲蛻皮激素的初級來源為卵巢相符[33-34]。昆蟲頭部作為感知嗅覺、觸覺、聽覺的部位，AhCYP307A1在蓮草直胸跳甲頭部的特異性高表達(dá)是否表明其與頭部行使這些功能有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同樣值得關(guān)注的是，在一些非內(nèi)分泌的組織中，如中腸，也檢測到Halloween基因的表達(dá)，這些組織是否可以作為原發(fā)性或繼發(fā)性合成蛻皮激素的部位有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

克隆并鑒定得到蓮草直胸跳甲中6個Halloween基因家族成員，分析發(fā)現(xiàn)其均屬于 P450超家族且具有一定保守性。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，蓮草直胸跳甲6個Halloween基因家族成員的表達(dá)在不同發(fā)育時期存在差異，但大多在卵巢中高表達(dá)；表明其在不同發(fā)育時期及不同組織中可能具有不同的功能，根據(jù)表達(dá)模式推測可能對蓮草直胸跳甲的蛻皮與繁殖具有一定影響。