馬流產(chǎn)沙門氏菌的分離鑒定及其微量凝集抗體檢測方法的建立與應(yīng)用

郭奎，王寧，王金慧，初曉雨，趙語婷，郭巍，劉荻萩，胡哲，王曉鈞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069）

0 引言

【研究意義】建立一種敏感、特異、操作簡便和高通量的微量凝集方法，實(shí)現(xiàn)對馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體進(jìn)行快速檢測，對馬流產(chǎn)沙門氏菌引起的流產(chǎn)的流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】馬流產(chǎn)沙門氏菌病，又稱為馬副傷寒，是由馬流產(chǎn)沙門氏菌（Salmonella abortus equi）、鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium S. typhi）、都柏林沙門氏菌（S. dublin）等引起的以馬屬動物流產(chǎn)為特征的傳染病[1-2]。其中馬流產(chǎn)沙門氏菌是導(dǎo)致母馬妊娠晚期流產(chǎn)主要病原菌[3]，且只對馬屬動物具有致病性，具有菌體抗原4、12，鞭毛第二相抗原H-enx。早在18世紀(jì)末19世紀(jì)初，歐美地區(qū)發(fā)生過大批馬流產(chǎn)的現(xiàn)象，20世紀(jì) 70年代末，我國華北、西北、東北等養(yǎng)馬地區(qū)也陸續(xù)暴發(fā)馬流產(chǎn)沙門氏菌病，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，該病全年都可發(fā)生，主要發(fā)生于懷孕后期，大多數(shù)表現(xiàn)為散發(fā)，有時呈地方流行性。馬流產(chǎn)沙門氏菌易感染初孕馬，多數(shù)馬在發(fā)生流產(chǎn)前，一般無明顯臨床癥狀，突發(fā)流產(chǎn)，絕大多數(shù)為死胎，有少數(shù)存活的胎兒，在出生幾天后，也會發(fā)生死亡[4-5]。妊娠母馬流產(chǎn)時, 病原菌隨流產(chǎn)胎兒、胎衣、羊水及陰道分泌物排出體外, 病公馬能隨精液排菌[6]。感染馬流產(chǎn)沙門氏菌的馬常成為該菌的攜帶者，也通常被認(rèn)為是非疫區(qū)最初傳染源[7]。盡管該病在歐洲國家及美國等得到嚴(yán)格控制[8]，也有一些國家仍有零散發(fā)生，比如克羅地亞（歐洲）報道發(fā)生了 2起流產(chǎn)，流產(chǎn)率分別為 11%和 44%；非洲及亞洲國家，該病仍然尚未得到控制，該病在阿根廷和日本也有報道[7,10-11]；我國在20世紀(jì)80年代多次暴發(fā)該病[4-5,12-13]，但在之后的 30多年中，鮮有該病的報道，一直沒有引起行業(yè)內(nèi)的關(guān)注，國內(nèi)外的相關(guān)研究并不多見，也不深入，是一種被忽視的傳染病。直到 2014年我國內(nèi)蒙古東部最先出現(xiàn)大批馬流產(chǎn)，流產(chǎn)率高達(dá)66.7%，此后的幾年里，我國多地持續(xù)流行該病，流產(chǎn)率為 30%—100%，其中大部分為草原上開放式散養(yǎng)的馬群，該病的發(fā)生直接影響了我國馬匹的存欄量、造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病目前呈蔓延的趨勢，對我國馬業(yè)持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了潛在的威脅和巨大的影響，嚴(yán)重阻礙了我國馬業(yè)的發(fā)展。細(xì)菌的病原學(xué)檢測方法主要包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、革蘭氏染色、生化特性分析、血清型的檢測等，以及基因組PCR[14-18]鑒定、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification LAMP）[19-20]等分子生物學(xué)手段。細(xì)菌的血清學(xué)方法主要有玻片凝集、試管凝集試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)、ELISA等，其中微量試驗(yàn)的應(yīng)用較為廣泛。王晶鈺等[21]建立了檢測雞大腸桿菌抗體的微量凝集試驗(yàn)，證實(shí)免疫后抗體效價與免疫保護(hù)效果呈正相關(guān)；徐為中等[22]建立了檢測兔大腸桿菌的微量凝集方法，利用該方法監(jiān)測免疫滅活疫苗后家兔大腸桿菌抗體水平。【本研究切入點(diǎn)】目前，還沒有關(guān)于馬流產(chǎn)沙門氏菌病原學(xué)系統(tǒng)的診斷方法，同時血清學(xué)的診斷方法也有限，主要依據(jù)傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行診斷，然而該方法的凝集結(jié)果往往不易判讀，使用試管操作難免耗時費(fèi)力，不適合大樣本的檢測。急需建立一種有效的微量凝集方法，提高檢測效率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采集疑似流產(chǎn)病例的流產(chǎn)馬駒組織，進(jìn)行了系統(tǒng)的病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷，對流產(chǎn)馬駒的臟器進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌分離和鑒定，并以其中一株分離株制備了凝集抗原，對比馬流產(chǎn)沙門氏菌試管凝集血清學(xué)檢測方法，旨在建立一種實(shí)現(xiàn)高通量新型微量凝集抗體檢測方法，為臨床馬流產(chǎn)沙門氏菌病的診斷和疫苗抗體評估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年3月至2019年9月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，由馬傳染病與慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)進(jìn)行。

1.1 質(zhì)粒和菌株及樣品

PMD18T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自上?？禐槭兰o(jì)有限公司；17份流產(chǎn)馬駒組織（心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、臍帶）采自內(nèi)蒙古3個不同地區(qū)；120份馬血清采自流產(chǎn)暴發(fā)地區(qū)，31份血清采取北京無流產(chǎn)疫情的地區(qū)。C77-1馬流產(chǎn)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自上海欣中生物工程有限公司；沙門氏增菌液購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、高純度質(zhì)粒小提試劑盒（Pureplasmid Mini Kit）等均購自康為世紀(jì)有限公司；細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）購自TIANGEN；革蘭氏染色液，沙門氏菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；馬流產(chǎn)沙門氏菌鞭毛蛋白血清H：e,n,x（貨號：53824）購自哈爾濱賽德洪澤科技發(fā)展有限公司；馬流產(chǎn)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)凝集抗原及陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（效價為1∶6 400），馬傳染性貧血病毒（Equine infections anemin virus, EIAV）、馬流感病毒（Equine innuenza virus, EIV,（H7N7、H3N8））、馬皰疹病毒（Equine herpes virus, EHV, I型、II型、III型、IV型、VII型）、馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus, EAV）、馬鏈球菌（Streptococcus equi,S.equi）、鼠傷寒沙門氏菌等陽性血清及馬流產(chǎn)沙門氏菌陰性血清保存哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.3 病原菌的初步分離及鑒定

用接種環(huán)沾取臟器浸出液，劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)18—24h，第二天觀察菌落的顏色。在顯色培養(yǎng)基上，革蘭氏陽性菌被抑制，大腸埃希氏菌為藍(lán)色。某些芽孢桿菌呈無色，沙門氏菌為淡紫色。挑取沙門氏菌選擇培養(yǎng)基上可疑菌落，參照革蘭氏染色說明書，進(jìn)行革蘭氏染色，并置于1 000倍光學(xué)顯微觀察下觀察細(xì)菌的顏色、形態(tài)、大小。

1.4 分離菌16S rRNA鑒定及序列分析

挑取單菌落，接種于沙門氏菌選擇培養(yǎng)基，37℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)12h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取17株細(xì)菌DNA，并以此為模板，擴(kuò)增16S rRNA基因。反應(yīng)體系20 μL：2×Taq Master Mix，10 μL；P1/P2，1 μL； ddH2O，6 μL；模板，2 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，共35個循環(huán)；72℃終延伸7 min；待PCR反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。獲得預(yù)期大小目的條帶后，將剩余PCR產(chǎn)物送去吉林庫美生物公司進(jìn)行測序。

1.5 沙門氏菌的生化鑒定及血清型鑒定

挑取16S rRNA鑒定為沙門氏菌的單菌落，參考生化鑒定試劑盒說明書進(jìn)行生化鑒定，并在規(guī)定時間內(nèi)判定結(jié)果。同時劃線接種于 0.5%的低濃度瓊脂的LB平板，37℃培養(yǎng)16h，參照沙門氏菌屬血清型鑒定說明書，對菌株進(jìn)行鑒定。

1.6 馬流產(chǎn)沙門氏菌凝集抗原制備

選取E.S-1菌株，進(jìn)行凝集抗原的制備。首先挑取單個菌落于5 mL沙門氏菌增菌液中，37℃，180 r/min培養(yǎng)16h，第二天以1∶100接種沙門氏菌增菌液，37℃，180 r/min培養(yǎng)8 h，參照平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液按照 0.2%體積比例加入甲醛，在 28℃，130 r/min滅活，分別在滅活24、48 h后，進(jìn)行滅活效果驗(yàn)證。完全滅活后，方可作為凝集抗原。

1.7 試管凝集試驗(yàn)

試管凝集試驗(yàn)按照NY_T570-2002行標(biāo)進(jìn)行，以分離株作為凝集抗原，根據(jù)購買的1∶6 400效價的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，確定凝集抗原工作濃度，并用于臨床樣品血清抗體的檢測。

1.8 微量凝集試驗(yàn)最佳抗原濃度的確定

利用制備的凝集抗原，進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)反應(yīng)條件的優(yōu)化。對陽性血清，在96孔U型板上進(jìn)行2倍比稀釋，分別與作不同濃度稀釋的抗原反應(yīng)，并設(shè)生理鹽水對照，利用封板膜封閉。室溫放置，20 h后判定結(jié)果。選取微量凝集最佳的抗原濃度，從而確定最佳抗原濃度。判定條件：“?！笨乖贵w呈均勻分布，凝集成薄層，即 100%抗原被凝集 ；“+++”：凝集反應(yīng)孔底能看到少許沉淀，即 75%抗原被凝集；“++ ”：凝集板底呈點(diǎn)狀沉淀，但傾斜時，沉淀不流動，即50%抗原被凝集；“+” ：凝集板底有沉淀，但傾斜時，只有少許沉淀呈線狀流動，即25%抗原被凝集；“-” ：凝集板底呈點(diǎn)狀沉淀，但傾斜時，沉淀呈線狀完全流下，即抗原未被或少部分血清被凝集。樣品結(jié)果參考NY_T570-2002判定，陽性反應(yīng)：1∶1 600 凝集強(qiáng)度達(dá)“++”或以上時，用“+”表示；可疑反應(yīng)：1∶800 凝集強(qiáng)度達(dá)“++”或以上時，用“+”表示；陰性反應(yīng)：1∶800 凝集強(qiáng)度只達(dá)“+”或以下時，用“-”表示。

1.9 敏感性試驗(yàn)

利用微量凝集優(yōu)化的最佳抗原濃度（4億/mL）、試管凝集凝集抗原濃度（2億/mL）及馬流產(chǎn)沙門氏菌參考凝集抗原[23]，對馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清（標(biāo)定效價6400）進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，每次3個重復(fù)。

1.10 特異性試驗(yàn)

利用微量凝集方法，對馬流產(chǎn)沙門氏菌、馬傳染性貧血病病毒、馬流感病毒（H7N7、H3N8）、馬動脈炎病毒、馬皰疹病毒（I型、II型、III型、IV型、VII型）、馬腺疫鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清進(jìn)行檢測。

1.11 微量凝集對臨床樣本的檢測

用微量凝集檢測方法對臨床151份馬血清樣品進(jìn)行檢測，并隨機(jī)選取30份，做試管凝集試驗(yàn)，并對兩種檢測方法結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 沙門氏菌的分離及鑒定

沙門氏菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上呈紫色，大腸桿菌呈藍(lán)色，革蘭氏陽性菌可抑制。從內(nèi)蒙古地區(qū)（17/17）采集的各臟器劃線結(jié)果可以觀察到有大量紫色菌落（圖 1），初步證明各臟器組織內(nèi)含有沙門氏菌，分離菌分別命名為 E.S-1—17菌株。革蘭氏染色鏡檢顯示為革蘭氏陰性短桿菌（圖略）。

圖1 沙門氏菌的分離與鑒定Fig. 1 Isolate and identification of Salmonella

2.2 16S rRNA克隆、鑒定及遺傳分析

將獲得17株分離株分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳初步表明，獲得了1條約1 500bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相一致（圖 2）。將 E.S-1—17株的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，氨基酸同源性和核苷酸同源性分析結(jié)果表明，E.S-1—17的16S基因組與C77-1序列完全一致，同源性為100%，與同屬沙門氏菌AL513382-Typhimurium（鼠傷寒沙門氏菌）、CP000026-Paratyphi A（甲型副傷寒沙門氏菌）、CP000857- Paratyphi C（丙型副傷寒沙門氏菌）、NZ_CM001062-Choleraesuis（豬霍亂沙門氏菌）、P125109-Enteritidis（腸炎沙門氏菌）同源性為 97.4%—99.7%，而與其他細(xì)菌同源性為38.4%—40.7%，選取E.S株的的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示，沙門氏菌屬與其他種屬細(xì)菌的同源性低，具有獨(dú)立的分支，屬內(nèi)細(xì)菌間同源性較高（圖3）。

圖2 16S 基因的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR amplification of 16S gene

圖3 不同細(xì)菌16S rRNA 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic trees of 16S rRNA gene of different bacteria

2.3 分離菌株血清型鑒定及生化鑒定

利用沙門氏菌屬診斷血清及馬流產(chǎn)沙門氏菌鞭毛蛋白血清H：e,n,x，對各菌株進(jìn)行血清型鑒定（圖4）：結(jié)果顯示各菌株均與 O4-012混合血清（左圖）及鞭毛第二相血清H-enx凝集（右圖），獲得的抗原式為O4,O12，H-e,n,x，經(jīng)鑒定各分離菌株均為沙門氏菌B群的馬流產(chǎn)沙門氏菌。將獲得的17株馬流產(chǎn)沙門氏菌和C77-1分別進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果如表1所示，標(biāo)準(zhǔn)株C77-1菌株與NY_T570-2002馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷技術(shù)中所述一致；而E.S-1—17各株除不能發(fā)酵鼠李糖之外，其他生化鑒定結(jié)果均與C77-1結(jié)果一致。

2.4 試管凝集最佳抗原濃度的確定

根據(jù)試管凝集結(jié)果，確定了試管凝集最佳抗原濃度為 2億/mL，該方法可以應(yīng)用于臨床樣品血清抗體的檢測。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification of the E.S-1-17 strains

圖4 馬流產(chǎn)沙門氏菌的凝集結(jié)果Fig. 4 Result of agglutination for Salmonella abortus equi

2.5 微量凝集試驗(yàn)最佳抗原反應(yīng)濃度的選擇

由表2可以看出，當(dāng)抗原（E.S-1）濃度為4億/mL時，檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清的抗體凝集效價最高為1∶12 800，且結(jié)果最易判讀。當(dāng)抗原濃度2億/mL以下時，則空白對照判讀十分困難，因此選擇4億/mL為最佳抗原反應(yīng)濃度。

表2 不同抗原濃度的微量凝集反應(yīng)結(jié)果Table 2 Results of microagglutination with different antigen concentrations

2.6 敏感性試驗(yàn)

以E.S-1作為凝集抗原，分別利用試管凝集和微量凝集試驗(yàn)，檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清的效價，試管凝集效價陽性血清效價可以達(dá)到1∶6 400，微量凝集效價可以達(dá)到1∶12 800，利用參考凝集抗原，試管凝集效價結(jié)果表明陽性血清效價為1∶6 400。因此微量凝集敏感性高于試管凝集試驗(yàn)。

2.7 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用不同的馬傳染病陽性血清進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，該微量凝集試驗(yàn)僅能檢測出馬流產(chǎn)沙門氏菌陽性血清（凝集效價為1∶12 800）為陽性，其他血清均為陰性（凝集效價均低于1∶1 600）。因此該方法對馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體檢測具有良好的特異性。

2.8 微量凝集抗體檢測方法的初步應(yīng)用

應(yīng)用微量對臨床151份樣品進(jìn)行馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體的檢測，以凝集價 1∶1 600為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果如表4所示，流產(chǎn)流行地區(qū)，馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體陽性率為27.3%—42.9%，非流產(chǎn)流行區(qū)，馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體陽性率0。為了比較兩種方法的診斷敏感性，隨機(jī)選取 30份臨床樣品，進(jìn)一步進(jìn)行了試管凝集抗體的檢測，結(jié)果表明陽性率為10%（表5），低于微量凝集試驗(yàn)（33.3%），試管凝集陽性3份，微量凝集陽性10份，其中試管凝集陽性的3份，微量凝集結(jié)果均陽性，因此，以試管凝集為標(biāo)準(zhǔn)（表6），微量凝集診斷敏感性為100%（3/3），診斷特異性為74.1%（20/27）。

表3 微量凝集反應(yīng)的特異性試驗(yàn)Table 3 Specific test results of microagglutination

表4 臨床樣本的檢測Table 4 Test results of clinical samples

表5 兩種檢測方法的比較Table 5 Comparison of the two detection methods

表6 兩種方法診斷敏感性的比較Table 6 Comparison of diagnostic sensitivity between the two methods

3 討論

隨著國家對賽馬行業(yè)的開放及驢相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，馬驢的數(shù)量在不斷上升。隨之而來的傳染病越來越多，病毒性疾病有馬流感，馬病毒性動脈炎、馬鼻肺炎等，細(xì)菌性病有由馬鏈球菌馬亞種引起的腺疫、馬流產(chǎn)沙門氏菌引起的流產(chǎn)等[24-25]。環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理、細(xì)菌性因素，病毒性因素等均可引起馬屬動物的流產(chǎn)，其中細(xì)菌性流產(chǎn)占主要部分[26-27]。馬流產(chǎn)沙門氏菌病自21世紀(jì)來在我國鮮有報道，近幾年，馬流產(chǎn)持續(xù)零散暴發(fā)，造成大量懷孕馬流產(chǎn)，給我國馬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。但對發(fā)病原因一直沒有深入研究，經(jīng)過本試驗(yàn)對內(nèi)蒙古流產(chǎn)馬駒臟器進(jìn)行系統(tǒng)的病原學(xué)檢測，最終確認(rèn)為馬流產(chǎn)沙門氏菌感染。由此提示，該病已在我國內(nèi)蒙古地區(qū)流行，需要及時采取針對性的預(yù)防和控制措施。NY_T570-2002馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷技術(shù)明確指出，細(xì)菌學(xué)的檢測結(jié)果是確診馬流產(chǎn)沙門氏菌病的依據(jù)。本研究通過沙門氏菌顯色培養(yǎng)基篩選、革蘭氏染色鑒定、16S基因組序列分析結(jié)果表明，從流產(chǎn)馬駒分離到的17株均為沙門氏菌，利用沙門氏菌屬血清型分析鑒定，E.S-1—17菌株，均具有菌體抗原O4，O12，鞭毛I(xiàn)I相抗原H-enx，證明分離到的菌株為馬流產(chǎn)沙門氏菌。利用各種型特異性鞭毛抗血清對細(xì)菌鞭毛蛋白抗原型的鑒定過程中，往往存在假陰性結(jié)果，主要是因?yàn)槌Ｒ?guī)方法培養(yǎng)獲得的菌體，鞭毛蛋白的表達(dá)不佳或者表達(dá)量很低，影響凝集結(jié)果的判定，可采取低濃度瓊脂培養(yǎng)法，誘導(dǎo)鞭毛蛋白表達(dá)；此外也與H-enx血清質(zhì)量有關(guān)。E.S-1—17菌株生化鑒定結(jié)果符合馬流產(chǎn)沙門氏菌的生化特性，但與NY_T570-2002中馬流產(chǎn)沙門氏菌菌株相比均不能發(fā)酵鼠李糖，這是新分離株在進(jìn)化上形成的新的生化特性。

NY_T570-2002馬流產(chǎn)沙門氏菌病診斷技術(shù)明確指出血清學(xué)檢測結(jié)果是針對馬流產(chǎn)沙門氏菌病的一種輔助手段，但血清學(xué)檢查對馬群的檢疫是有意義的。由于該病很多年未發(fā)生，近幾年該病突然暴發(fā)時，缺少可用商品化的凝集抗原，因此，為解決臨床樣本的檢測，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用分離菌株，制備了凝集抗原，以馬流產(chǎn)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，優(yōu)化了試管凝集抗原濃度（為 2億/mL），但是試管凝集試驗(yàn)需要血清量大（送檢的血清量有時滿足不了要求），此外，試管凝集試驗(yàn)需要不斷稀釋，每次只能做一支試管，操作繁瑣，不適合大量樣本的檢測，為克服試管凝集檢測方法的弊端，本研究建立了一種微量凝集抗體檢測方法，該方法與試管凝集相比，具有良好的操作性，可以多個樣品同時進(jìn)行稀釋，而且可以同時判定多個樣品凝集結(jié)果，在加樣時間及判讀結(jié)果時間上至少縮短20倍，提高了檢測效率；血清用量減少50倍，凝集抗原量減少10倍，試管耗材等減少了使用，大大降低成本。本研究研制的微量凝集試驗(yàn)，特異性好，對其他馬常見傳染病陽性血清檢測結(jié)果均陰性，敏感性比試管凝集高1個滴度，對于臨床相同的30份樣品，利用兩種方法進(jìn)行試驗(yàn)，微量凝集檢測陽性率為 33.3%高于試管凝集（10%），以試管凝集結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，微量凝集與試管凝集相比，診斷敏感性為100%，診斷特異性為74.1%。

利用建立的微量凝集檢測方法，對151份馬血清樣品進(jìn)行檢測，流產(chǎn)暴發(fā)區(qū)馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體陽性率27.3 %—42.9%，略低于臨床流產(chǎn)率（30 %—100%），可能有以下五個方面的原因：1.樣品數(shù)量有限，不能代表整體的現(xiàn)狀，此外臨床流產(chǎn)時間不同，抗體有所差異。2.不同的病原也可以引起流產(chǎn)，如馬 I型皰疹病毒、馬VIII型皰疹病毒[28]、馬動脈炎病毒，可能還有一些未知病原（本研究利用real-time PCR方法對馬皰疹病毒、馬動脈炎病毒核酸進(jìn)行了排除）。3.非傳染病因素如飼養(yǎng)管理、環(huán)境因素等。4.試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)可能偏高。筆者判定的標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù) NY_T570-2002國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的判定（反應(yīng)20h，1∶1 600“++”及以上判定陽性，）?？陀^上，認(rèn)為設(shè)定判定標(biāo)準(zhǔn)與疫病對人類的危害程度相關(guān)，對人類影響越大，判定陽性的稀釋度越低。如牛羊布氏桿菌病 1∶50“++”以上時判定陽性[29]，5.不同病原抗體凝集試驗(yàn)的反應(yīng)時間不同，理論上反應(yīng)時間越長，對結(jié)果判定準(zhǔn)確性越高，因此本研究反應(yīng)時間為 20h。此外，本研究建立的微量凝集與楊康[30]建立的馬流產(chǎn)沙門氏菌微量凝集方法不同，楊康建立的微量凝集反應(yīng)時間為 2—3h，血清稀釋度為1∶40，做4個重復(fù)，當(dāng)出現(xiàn)“++”及以上時，即將樣品判定陽性。判定標(biāo)準(zhǔn)過低，可能在一定程度上會造成假陽性，我們建立微量凝集，可以知道馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體的具體效價，是對研發(fā)新的疫苗效果評估的重要手段。

綜上所述，本研究成功分離并鑒定出17株馬流產(chǎn)沙門氏菌，并利用其中的一株E.S-1菌株作為凝集抗原，成功建立了檢測馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體的微量凝集方法，該方法可以大批量操作，可以應(yīng)用于臨床各種馬屬動物的馬流產(chǎn)沙門氏菌抗體及疫苗抗體效價檢測，對于大規(guī)模疫病的監(jiān)測和防控具有重要的意義。

4 結(jié)論

對流產(chǎn)馬駒的臟器進(jìn)行細(xì)菌分離，通過對分離菌進(jìn)行沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、革蘭氏染色、16S rRNA測定證實(shí)分離菌株為沙門氏菌；生化鑒定表明，分離菌株符合馬流產(chǎn)沙門氏菌生化特性，但與C77-1相比，均不能發(fā)酵鼠李糖。通過利用低濃度瓊脂誘導(dǎo)鞭毛蛋白表達(dá)，證實(shí)分離菌株血清型為馬流產(chǎn)沙門氏菌，并將菌株命名為E.S-1—17，并以E.S-1菌株為凝集抗原，通過優(yōu)化抗原濃度建立了微量凝集檢測方法，該方法與試管凝集相比，具有較高的敏感性和批量操作性，更適合應(yīng)用于馬屬動物的馬流產(chǎn)沙門氏菌病的抗體檢測以及疫苗免疫抗體消長規(guī)律的評價。