混菌靜態(tài)發(fā)酵改善雙低菜籽粕品質(zhì)

郝怡寧，王志高，何榮，鞠興榮，袁建

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

0 引言

【研究意義】菜籽粕（rapeseed meal，RSM）作為菜籽油的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量超過4 000萬t，在蛋白質(zhì)餅粕的產(chǎn)量中僅次于豆粕（Soybean meal，SBM），排名第二位[1]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，油菜籽的產(chǎn)量居世界第一，菜籽粕的年產(chǎn)量已超過1 000萬t[2]。菜籽粕是一種重要的蛋白質(zhì)資源，由于其富含粗蛋白、蛋氨酸、賴氨酸等營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所以其發(fā)展?jié)摿薮蟆５遣俗哑芍写嬖谝恍┛範(fàn)I養(yǎng)因子，如硫代葡萄糖苷、粗纖維、植酸等，特別是高水平的硫代葡萄糖苷，會(huì)降低適口性，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、甲狀腺腫大和器官組織受損[3]；此外，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子可以使消化酶失活，降低高活性肽的釋放速率，從而降低營(yíng)養(yǎng)利用率。因此，過去的很多研究都側(cè)重于去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，而忽略了營(yíng)養(yǎng)因子的增加[4-5]。隨著雙低菜籽粕的出現(xiàn)，提高菜籽粕的綜合品質(zhì)，改善菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)就顯得尤為重要。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及呈味物質(zhì)組成是評(píng)價(jià)農(nóng)產(chǎn)品特別是飼用經(jīng)濟(jì)作物品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。采用電子鼻和電子舌快速檢測(cè)菜籽粕發(fā)酵過程中風(fēng)味變化的綜合信息，對(duì)提高菜籽粕品質(zhì)具有重要的意義。在目前我國(guó)蛋白資源緊缺的情況下，改善菜籽粕品質(zhì)，提高菜籽粕的利用率，可推動(dòng)我國(guó)畜牧和食品工業(yè)的發(fā)展，并帶來顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了降低成本，緩解資源短缺的現(xiàn)狀，許多研究人員一直在急于尋找其他的蛋白來源來降低豆粕的使用[6]。酶解法已經(jīng)被用來提高菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，主要是增加小肽含量，但是酶解效率低，并且成本較高。微生物發(fā)酵被認(rèn)為是一種去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的替代方案。前人的研究表明，微生物發(fā)酵可以增加菜籽粕中小肽含量[7]，提高適口性，從而提高營(yíng)養(yǎng)利用率，但不同菌種的發(fā)酵效果不同。顧斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌和白地霉混菌發(fā)酵可以提高菜籽粕中蛋白的效價(jià)，降低抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。小鼠試驗(yàn)表明，在飼糧中添加一定比例的發(fā)酵菜籽粕雖然能夠促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)，但是長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)小鼠的肝臟和腎臟造成輕度損傷。WANG等[2]利用乳酸菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)生乳酸促進(jìn)酸味，通過蛋白質(zhì)變性來降低咀嚼性，從而提高適口性，增加消費(fèi)者的接受度。【本研究切入點(diǎn)】過去為了提高菜籽粕的利用率，微生物發(fā)酵的研究多集中于菜籽粕脫毒上，而忽略了提高和改善菜籽粕的綜合品質(zhì)，造成了資源浪費(fèi)。氣味和滋味是評(píng)價(jià)發(fā)酵菜籽粕綜合品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，但微生物發(fā)酵對(duì)菜籽粕風(fēng)味物質(zhì)及呈味物質(zhì)影響的研究未見報(bào)道。通過靜態(tài)發(fā)酵代替攪拌式發(fā)酵，降低大規(guī)模發(fā)酵的生產(chǎn)成本。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用混菌靜態(tài)發(fā)酵工藝，在降低抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上豐富菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)。利用電子鼻和電子舌等綜合分析技術(shù)，研究發(fā)酵前后以及發(fā)酵過程中菜籽粕氣味與滋味的變化，并通過體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)酵菜籽粕的生物可利用性，全面探討靜態(tài)發(fā)酵工藝對(duì)菜籽粕品質(zhì)特性的影響，為菜籽粕的廣泛利用和深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2018年在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。動(dòng)物試驗(yàn)于2019年1月在南京申基生物有限公司進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis20030、雅致放射毛霉Actinomucor elegans40252，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.1 主要原料 甘藍(lán)型雙低菜籽粕，粉碎后過 60目篩備用。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌肽、還原型谷胱甘肽、甘氨酸、甲醇（色譜純）、川芎嗪標(biāo)品，上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher公司；恒溫培養(yǎng)震蕩器，上海智城分析儀制造有限公司；味覺分析儀--ASTREE電子舌、α-FOX3000電子鼻，法國(guó) Alpha MOS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靜態(tài)發(fā)酵 發(fā)酵之前混合物組成為：190 g菜籽粕和10 g麥麩混合，加入270 mL蒸餾水（包含0.5%的葡萄糖和0.36% KH2PO4）。將混合物在120℃條件下滅菌20 min，在超凈臺(tái)內(nèi)冷卻后接種枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉，接種比例為4∶1，攪拌均勻后在32℃下靜置5 d，每隔1 d取樣。取出菜籽粕樣品在50℃下烘干，時(shí)間為36 h。將烘干后的菜籽粕磨成粉，過60目篩，保存在4℃條件下備用。

1.3.2 菜籽粕（抗）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定 硫甙：氯化鈀法[9]；粗纖維：酸堿消煮法，GB/T6434—2006；植酸：三氯化鐵比色法[10]；粗蛋白、水溶性蛋白：NYT 1205—2006；多肽：參考魯偉等[11]的方法。

1.3.3 氨基酸的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取一定量樣品于水解管中，在減壓條件下加6 mol·L-1鹽酸，密封后在110℃高溫下水解24 h，將水解液過濾后旋蒸除去鹽酸至干，用 0.02 mol·L-1的鹽酸定容至 50 mL，稀釋兩倍后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.3.4 多肽分子量分布的測(cè)定 TSKgel G2000SWXL色譜條件參考谷中華等[12]的方法。分子量標(biāo)品為細(xì)胞色素C（MW 12327 D）、抑肽酶（MW 6511.51 D）、桿菌肽（MW 1422.69 D）、還原型谷胱甘肽（MW 307.32 D）、甘氨酸（MW 75.067 D）

1.3.5 川芎嗪的檢測(cè)

1.3.5.1 色譜條件 參考蘭順[13]的方法，并稍作修改。色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇：超純水（50∶50 V/V）；流速：0.7 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；柱溫：室溫。

1.3.5.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取 TTMP標(biāo)品于適當(dāng)體積的甲醇中，制備濃度為20 μg·mL-1的母液。取標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分別制成濃度為 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 和 16.0 μg·mL-1的溶液。

1.3.5.3 樣品溶液的配制 以甲醇為溶劑，料液比1∶40，超聲提取30 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。

1.3.6 電子鼻感官評(píng)價(jià) 精確稱取 2.00 g菜籽粕樣品放置于20 mL頂空瓶?jī)?nèi)，樣品測(cè)量流速為150 mL·min-1，檢測(cè)時(shí)間為120 s。該電子鼻裝有12個(gè)不同的氣體傳感器：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2和PA/2，通過傳感器陣列響應(yīng)和模式識(shí)別技術(shù)對(duì)揮發(fā)性氣體分子進(jìn)行分析。

1.3.7 電子舌感官評(píng)價(jià) 準(zhǔn)確取2.00 g待測(cè)樣品，加入蒸餾水后搖勻，定容后倒入測(cè)量杯進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)所用的Astree電子舌系統(tǒng)配置了AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS和SCS 7根傳感器，其中AHS、CTS、NMS、ANS和SCS為5根專一性傳感器，分別對(duì)酸、咸、鮮、甜和苦具有專一響應(yīng)。測(cè)定時(shí)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)采集時(shí)間為120 s，記錄第120 s時(shí)傳感器的響應(yīng)值，用于后續(xù)分析。

1.3.8 動(dòng)物試驗(yàn) 按體重將 Spargue-Dawlcy大鼠分為空白豆粕組（SBM組）和試驗(yàn)菜籽粕組（FRSM組，發(fā)酵菜籽粕等氮代替基礎(chǔ)飼糧25%的豆粕），每組6只，兩組大鼠初始平均體重分別為53.9和54.6 g。試驗(yàn)周期為42 d，每隔7 d稱重測(cè)定平均日增重和平均日采食量。參考湯震等[14]的方法，取腎臟、肝臟胸腺和脾臟，對(duì)胸腺和脾臟分別稱重，測(cè)定大鼠免疫器官指數(shù)。對(duì)大鼠腎臟、肝臟和胸腺進(jìn)行病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，所得結(jié)果以平均值形式表示。采用Origin 8.5繪圖，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析評(píng)價(jià)兩組間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 混菌靜態(tài)發(fā)酵對(duì)雙低菜籽粕營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.1.1 對(duì)硫甙葡萄糖苷、粗纖維、植酸與蛋白的影響 由圖1-A可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，硫甙葡萄糖苷、粗纖維和植酸的含量逐漸降低。硫代葡萄糖苷的含量由 20.37 μmol·g-1降至 11.15 μmol·g-1，降解率達(dá) 45.26%。粗纖維和植酸的降解率分別為31.16%和41.37%。由圖1-B可知，粗蛋白、水溶性蛋白和多肽的含量均在發(fā)酵后期有顯著增長(zhǎng)。發(fā)酵后菜籽粕中水溶性蛋白的含量由 10.3%顯著增加到20.26%，多肽含量由2.7%增加到10.3%，增加率高達(dá)281.48%。

圖1 靜態(tài)發(fā)酵對(duì)菜籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)（A）和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（B）的影響Fig. 1 Effect of static fermentation on antinutrients (A) and nutrients (B) in rapeseed meal

2.1.2 對(duì)多肽分子量分布的影響 如圖2所示，未發(fā)酵菜籽粕中主要含有高分子量的蛋白質(zhì)，經(jīng)過微生物發(fā)酵，蛋白質(zhì)被水解成氨基酸和分子量在180—7 000 Da的多肽。發(fā)酵第3天，1 586 Da之前的峰值已經(jīng)不存在，當(dāng)發(fā)酵第5天時(shí)，大部分菜籽多肽被降解為分子量在500—108 Da的小分子肽。

2.1.3 對(duì)氨基酸組成的影響 發(fā)酵前后氨基酸總量和組成發(fā)生了顯著性變化（表 1），但發(fā)酵第 3天與發(fā)酵第5天的菜籽粕氨基酸總量無明顯變化。發(fā)酵5 d后，菜籽粕中氨基酸總量增加了19.58%，必須氨基酸總量增加了25.30%。半胱氨酸和苯丙氨酸的增幅較大，分別為96.88%和74.55%，賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸的增幅較低，分別為13.25%、14.39%和7.78%。

2.1.4 對(duì)川芎嗪含量的影響 由圖3可知，在菜籽粕中并未發(fā)現(xiàn)川芎嗪，發(fā)酵1 d后川芎嗪以一種新的物質(zhì)出現(xiàn)，并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，川芎嗪的含量迅速增加，在發(fā)酵第5天達(dá)到590 mg·kg-1。

2.2 混菌靜態(tài)發(fā)酵對(duì)雙低菜籽氣味的影響

由于揮發(fā)性化合物的任何輕微變化都會(huì)引起電子鼻傳感器響應(yīng)的差異[15]，因此，電子鼻技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品研究[16]。在本研究中，利用配備 12個(gè)傳感器的電子鼻獲得菜籽粕的綜合風(fēng)味圖譜。每個(gè)傳感器的響應(yīng)幅度取決于氣味分子的組成和濃度[15]。用電子鼻分析菜籽粕和發(fā)酵1、3、5 d后的菜籽粕樣品，由圖4可知，4個(gè)樣品的指紋圖譜均存在顯著差異。圖 4-A 顯示，傳感器ly2/lg、pa/2、t70/2、p40/1、p10/2、p10/1、t30/1對(duì)4個(gè)樣品的響應(yīng)值均大于零，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。相反，除了傳感器LY2/gCT外，其他傳感器（LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL）的響應(yīng)是負(fù)的，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而降低。結(jié)果表明，生RSM和5 d樣品的揮發(fā)性成分在發(fā)酵過程中差異最大。這些差異可能是由于一些揮發(fā)性化合物的出現(xiàn)或消失以及相似揮發(fā)性化合物濃度的變化所造成[17]。雷達(dá)指紋圖譜顯示，發(fā)酵3 d和5 d后的菜籽粕香氣分布比其他分布更接近，說明它們的氣味相似性很高。

圖2 菜籽粕發(fā)酵過程中菜籽肽分子量分布Fig. 2 Molecular weight distribution of peptides in rapeseed meal during fermentation

表1 發(fā)酵菜籽粕中氨基酸的種類和含量Table 1 Types and contents of amino acids in rapeseed meal and fermented rapeseed meal

圖3 菜籽粕粕中川芎嗪的色譜圖（A）、川芎嗪在發(fā)酵過程中含量的變化（B）Fig. 3 Chromatographic charts of tetramethylpyrazine in rapeseed meal (A), changes of tetramethylpyrazine content during fermentation (B)

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間菜籽粕樣品的電子鼻的雷達(dá)圖（A）和PCA圖（B）Fig. 4 Radar fingerprint chart (A) and PCA (B) of electronic nose data for rapeseed meal at different fermentation times

圖4-B顯示菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕的主要成分1和2的貢獻(xiàn)率分別為96.51%和3.128%?？偡讲钬暙I(xiàn)率為99.638%（95%以上），表明該方法有效，反映了樣品提供的總體信息，因此在一定意義上可以代表樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要特征[18]。PCA結(jié)果表明，RSM的揮發(fā)性化合物位于第一象限，但其他發(fā)酵樣品位于不同的區(qū)域。這說明RSM與FRSM的揮發(fā)性物質(zhì)存在顯著差異。發(fā)酵1 d的樣品揮發(fā)性組分位于第二象限，遠(yuǎn)離發(fā)酵3 d和5 d的樣品，表明發(fā)酵前期對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有顯著的影響。樣品3 d組和5 d組雖然位于不同的象限內(nèi)，但它們之間的距離較近，說明發(fā)酵3 d后揮發(fā)性成分的含量和組成趨于穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，在電子鼻數(shù)據(jù)上使用PCA可以區(qū)分RSM和FRSM以及不同發(fā)酵時(shí)間的FRSM。

2.3 混菌靜態(tài)發(fā)酵對(duì)雙低菜籽粕滋味的影響

由圖5-A可知，AHS、SCS、ANS和NMS 4種傳感器對(duì)4種樣品具有較好的響應(yīng)。其中AHS和SCS的響應(yīng)值在發(fā)酵前后發(fā)生了明顯變化，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)值逐漸增大。雖然ANS和NMS的響應(yīng)值較高，但在發(fā)酵前后無明顯變化。說明菜籽粕本身就含有一定濃度的糖類、氨基酸、核苷酸和有機(jī)酸等甜味和鮮味貢獻(xiàn)物[19]。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間菜籽粕樣品的電子舌的雷達(dá)圖（A）和PCA圖（B）Fig. 5 Radar fingerprint chart (A) and PCA (B) of electronic tongue data for rapeseed meal at different fermentation times

如圖 5-B所示。PC1和 PC2的貢獻(xiàn)率分別為83.92%和 8.73%，兩者之和高達(dá) 92.65%，表明 PC1和PC2的總貢獻(xiàn)率幾乎包含了樣品的所有信息。RSM落于第一象限，與不同時(shí)間發(fā)酵菜籽粕的中心相距較遠(yuǎn)，表明發(fā)酵前后菜籽粕的芳香性物質(zhì)發(fā)生了很大變化。發(fā)酵1 d的發(fā)酵菜籽粕樣品位于第二象限，與發(fā)酵第3、5天的發(fā)酵菜籽粕樣品相距較遠(yuǎn)，能夠明顯區(qū)分開。發(fā)酵第3天和第5天的發(fā)酵菜籽粕都位于第四象限，且相距較近，說明它們滋味的相似性很高。

2.4 發(fā)酵菜籽粕對(duì)大鼠體重和免疫器官指數(shù)的影響

如表2所示，發(fā)酵5 d的菜籽粕等氮代替大鼠飼糧中25%的豆粕對(duì)大鼠的免疫器官指數(shù)和后期（21—42 d）平均日增重?zé)o明顯的影響，但可以顯著提高大鼠平均日采食量和前期（0—21 d）的平均日增重。

2.5 發(fā)酵菜籽粕對(duì)大鼠腎臟、肝臟和胸腺的影響

圖6 各組小鼠器官組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×200）Fig. 6 Spleen morphology of mice in all groups (HE staining, ×200)

表2 發(fā)酵菜籽粕對(duì)大鼠體重、采食量和免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of fermented rapeseed meal on body weight, feed intake and immune organ index in rats

兩組肝臟 HE染色結(jié)果顯示（圖6），肝細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核無增大，肝小葉組織形態(tài)良好，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。兩組腎臟HE染色結(jié)果顯示，腎臟組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見管型，間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)染色均勻，胞核居中，未見空泡樣變性、凋亡與壞死。兩組胸腺組織HE染色結(jié)果顯示正常，皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清晰。

3 討論

采用靜態(tài)發(fā)酵顯著降低了發(fā)酵菜籽粕中硫甙葡萄糖苷和植酸的濃度，與菜籽粕相比，分別降低了45.26%和41.37%。本研究中硫代葡萄糖苷的降解率低于陸豫等[5]的研究結(jié)果，一方面是由于雙低菜籽粕本身硫甙葡萄糖苷的濃度（低于30 μmol·g-1）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通菜粕；另一方面可能是由于微生物的選擇和優(yōu)化發(fā)酵條件的指標(biāo)不同。植酸降解率高于HU等[20]的研究，枯草芽孢桿菌不僅可以產(chǎn)生芥子酶來降解硫甙葡萄糖苷等化合物[21-22]，還可以分泌植酸酶[23]，能夠分解植酸并釋放植酸中的磷，提高動(dòng)物對(duì)磷的利用率。菜籽粕中富含粗纖維，可能會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)和氨基酸）的消化率。在本研究中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的纖維素酶顯著降低了菜籽粕中粗纖維的含量。菜籽粕中粗蛋白含量的增加是由于發(fā)酵過程中一些物質(zhì)被分解產(chǎn)生揮發(fā)性氣體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度在一定程度上濃縮。菜籽粕中多肽含量從 2.7%增加至10.3%，明顯高于WANG等[2]的研究（6.6%）。發(fā)酵過程中肽水平的增加是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白質(zhì)引起，菜籽多肽可能具有某些生物活性，因此，菜籽多肽是評(píng)價(jià)菜籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。此外，未發(fā)酵菜籽粕中主要含有高分子量蛋白質(zhì)，經(jīng)過發(fā)酵工藝，蛋白質(zhì)被水解成氨基酸和分子量在 180—7 000 Da范圍內(nèi)的小肽。從圖2可以看出，第3天時(shí)1 586 Da之前的峰值已經(jīng)不存在，表明這些蛋白質(zhì)對(duì)微生物蛋白酶降解的敏感性[7]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到第5天時(shí)，分子量在500—108 Da的小肽和氨基酸在菜籽粕中含量最豐富。這是由于枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌都具有產(chǎn)蛋白酶的能力，蛋白酶能夠?qū)⒋蠓肿拥牡鞍踪|(zhì)分解為多肽，并進(jìn)一步裂解為小分子寡肽和氨基酸殘基。與大分子蛋白質(zhì)相比，小肽具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因?yàn)樾‰牟粌H能被動(dòng)物腸道直接吸收，而且具有調(diào)節(jié)生理功能、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)氨基酸吸收等作用。菜籽多肽的生理活性取決于多肽分子量大小及氨基酸序列。菜籽粕比豆粕中氨基酸的組成更加有利和合理。菜籽粕中含有較多的甲硫氨酸和半胱氨酸，但含有較少的賴氨酸。賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸是限制某些動(dòng)物飼料營(yíng)養(yǎng)效率的 3種氨基酸[24]。賴氨酸和甲硫氨酸是蛋白質(zhì)飼料的重要營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[25]，蘇氨酸則是維持家畜和家禽生長(zhǎng)和免疫功能的必需氨基酸[26]。有些家禽，比如肉雞，本身不能產(chǎn)生精氨酸，所以需要通過進(jìn)食含有該氨基酸的膳食進(jìn)行補(bǔ)充[27]，因此，提高精氨酸在菜籽粕中的含量對(duì)今后將發(fā)酵菜籽粕運(yùn)用于雞飼料生產(chǎn)中有重要的意義。在本研究中，菜籽粕中必須氨基酸總量從發(fā)酵前的9.17%提高到發(fā)酵后的11.57%，提高率為26.17%，使得氨基酸的比例更為合理?？偘被岷康脑黾又饕俏⑸锇l(fā)酵合成支原體蛋白，這與 HE等[7]的研究結(jié)果相似。

發(fā)酵的菜籽粕中新檢測(cè)到川芎嗪，川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TTMP）又名四甲基吡嗪，是一種雜環(huán)含氮化合物，被廣泛用作風(fēng)味添加劑，具有烘烤、花生、榛子、可可等誘食性香氣[28]。此前有報(bào)道稱TTMP對(duì)食物的整體香氣有顯著貢獻(xiàn)[29]。TMPP也被認(rèn)為是發(fā)酵大豆和可可豆中的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物，含量隨著枯草芽孢桿菌數(shù)量的增加而增加[30-31]。曾有報(bào)道稱枯草芽孢桿菌能通過微生物代謝從頭合成 TMPP[32-33]。菜籽粕作為靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，富含糖、蛋白質(zhì)和氨基酸，為枯草芽孢桿菌形成TTMP提供了充足的底物。TTMP在發(fā)酵菜籽粕中含量很高，它不僅僅是一種天然風(fēng)味化合物，也是一種具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值的生物活性成分[34-35]。近期有報(bào)道稱，補(bǔ)充TTMP可顯著降低肉仔雞鼠傷寒沙門氏菌負(fù)荷和炎癥反應(yīng)[36]。此外，在食醋和白酒發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)了TTMP，它通常具有較低的風(fēng)味閾值，因此被認(rèn)為對(duì)醬香型風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，并將它的含量作為一項(xiàng)功能性指標(biāo)來評(píng)價(jià)食醋和白酒的質(zhì)量[29,37]。因此，TTMP的產(chǎn)生對(duì)提高發(fā)酵菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和整體風(fēng)味具有重要作用。綜上所述，本研究所采用的菌種類型及工藝可以提高菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

有研究表明，枯草芽孢桿菌可以改善豆粕的的風(fēng)味品質(zhì)，提高豆粕中吡嗪類的種類和含量[30]。經(jīng)雅致放射毛酶發(fā)酵的豆乳，酯類的含量明顯增提高[38]。本研究將枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌混菌發(fā)酵菜籽粕，得到的發(fā)酵菜籽粕兼具枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉的發(fā)酵香氣，豐富了發(fā)酵菜籽粕的風(fēng)味。電子舌的作用機(jī)理與鼻的作用機(jī)理相似，能夠通過電子傳感器檢測(cè)人類的味覺。本研究中，傳感器 AHS和 SCS的響應(yīng)值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，其中AHS代表酸味，WANG等[2]利用微生物發(fā)酵菜籽粕促進(jìn)酸味，認(rèn)為酸味可以提高適口性，增加消費(fèi)者的接受度。SCS代表苦味，發(fā)酵菜籽粕中苦味的增加可能是由于發(fā)酵后苦味氨基酸含量升高。雖然ANS和NMS在發(fā)酵前后無明顯變化，但是響應(yīng)值較高，說明菜籽粕本身就含有一定濃度的糖類、氨基酸、核苷酸和有機(jī)酸等甜味和鮮味貢獻(xiàn)物。

靜態(tài)發(fā)酵菜籽粕等氮代替基礎(chǔ)飼糧中25%的豆粕可以明顯提高大鼠的平均日增重日增重和平均日采食量，這與HU等[20]的研究結(jié)果相似。這可能與菜籽粕中蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致消化率的提高有關(guān)。HONG等[39]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵可以將SBM中的多肽分子量降低，小肽更有利于新斷奶仔豬的生長(zhǎng)。此外，靜態(tài)發(fā)酵能有效的降低抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)酸味增加，有利于提高菜籽粕的適口性。發(fā)酵后的特殊香氣也可能是導(dǎo)致動(dòng)物采食量增加的原因之一。如果飲食中硫甙葡萄糖苷的含量高，會(huì)導(dǎo)致腎臟和肝臟受損。組織病理學(xué)能可靠地反應(yīng)機(jī)體器官與組織的損傷程度以及功能性變化，也是間接反應(yīng)毒性程度所采用的主要方法。顧斌[8]曾在小鼠飼料中添加了15%的菜籽粕和發(fā)酵菜籽粕，發(fā)現(xiàn)與菜籽粕相比，添加同量的發(fā)酵菜籽粕能夠減輕菜籽粕對(duì)小鼠腎臟、肝臟和胸腺的損傷。本研究中，HE染色結(jié)果表明兩組大鼠的腎臟、肝臟和胸腺無顯著差異，表明發(fā)酵菜籽粕未對(duì)大鼠產(chǎn)生慢性毒性作用。

4 結(jié)果

從品質(zhì)角度看，本研究選用的有益菌（枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉菌）及發(fā)酵工藝顯著降低了菜籽粕的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的含量，提高了營(yíng)養(yǎng)成分的含量；并對(duì)滋味和氣味產(chǎn)生一定影響，特別是發(fā)酵后新產(chǎn)生的川芎嗪，不僅提高了菜籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并對(duì)菜籽粕的風(fēng)味產(chǎn)生積極的影響。從安全角度看，發(fā)酵菜籽粕添加到大鼠飼糧中可以促進(jìn)大鼠的生長(zhǎng)，且不會(huì)對(duì)大鼠的腎臟、肝臟和胸腺造成損傷。