利用野生甘藍(lán)改良油菜Ogu CMS恢復(fù)材料的菌核病抗性

萬華方，丁一娟，陳致富，梅家琴，錢偉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，重慶 400716）

0 引言

【研究意義】甘藍(lán)型油菜（Brassica napusL.，AACC，2n=38）是由白菜（Brassica rapaL., AA，2n=20）和甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.，CC，2n=18）雜交，并經(jīng)自然加倍演化而來，是世界上重要的糧油作物和能源作物。中國是世界第二大油菜種植國，其長江流域油菜產(chǎn)業(yè)常年受到腐生真菌核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）的嚴(yán)重危害。由于現(xiàn)有油菜中缺乏菌核病的有效抗源，抗病甘藍(lán)的發(fā)現(xiàn)為油菜抗病育種帶來了新的思路。細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），尤其是蘿卜胞質(zhì)不育系Ogu CMS的不育性十分穩(wěn)定，是蕓薹屬作物的安全授粉控制系統(tǒng)[1]，也是生產(chǎn)油菜雜交種最好利用的授粉控制系統(tǒng)之一。因此，以含有野生甘藍(lán)優(yōu)良抗病遺傳成分的人工合成甘藍(lán)型油菜為橋梁，培育抗菌核病的油菜Ogu CMS恢復(fù)系具有重要理論意義和實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】由于油菜基因庫中匱乏高抗或免疫的資源[2-5]，學(xué)者們已嘗試從油菜的近緣物種中去發(fā)掘優(yōu)良抗源[5-7]。作為油菜的親本物種之一，甘藍(lán)遺傳多樣性豐富[8-10]，并且由于其長期受到野生環(huán)境的自然選擇，存在優(yōu)良的抗病資源。野生甘藍(lán)B.incana具有良好的菌核病抗性，其莖稈抗病性可達(dá)到耐病油菜對(duì)照中油821的20倍[7]，其抗病QTL（quantitative trait locus）分布在C1、C3、C4、C7和C9等多條連鎖群[11]，與現(xiàn)已報(bào)道的油菜抗菌核病QTL位置不同[12-14]，其中，部分與甘藍(lán)抗病QTL連鎖的標(biāo)記已成功應(yīng)用于抗菌核病分子標(biāo)記輔助選擇[15-16]。為將此野生甘藍(lán)的菌核病抗病位點(diǎn)導(dǎo)入油菜，DING等[17]以其為抗源，與白菜進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，發(fā)展了人工合成甘藍(lán)型油菜，表現(xiàn)出較好的菌核病抗性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】油菜中已成功育成了甘藍(lán)型油菜Ogu胞質(zhì)不育系[18-19]及Ogu CMS的恢復(fù)系[20-22]，但受限于油菜抗源的匱乏，目前還沒有抗菌核病的油菜 Ogu CMS恢復(fù)系報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以人工合成甘藍(lán)型油菜橋梁，將野生甘藍(lán)的抗菌核病位點(diǎn)轉(zhuǎn)入油菜，發(fā)展具有甘藍(lán)抗病遺傳成分且含恢復(fù)基因的材料，為發(fā)展抗菌核病油菜Ogu CMS恢復(fù)系提供種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

田間試驗(yàn)于 2013—2016年在重慶市油菜工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地和內(nèi)蒙古大學(xué)試驗(yàn)基地（夏季加代繁殖）進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料及選育策略

前期以高抗菌核病野生甘藍(lán)B. incana（編號(hào)C01）與白菜（編號(hào)6Y733）雜交，經(jīng)胚挽救、染色體加倍獲得了抗菌核病的人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4（相對(duì)于中雙9號(hào)的枝稈和葉片，相對(duì)感病度S分別為0.75和0.57，雙高品質(zhì)）。以AC1-4為父本，對(duì)油菜Ogu CMS胞質(zhì)不育雜種4Q292（源于Ogu CMS油菜與常規(guī)油菜的雜種F1，感菌核病，雙低品質(zhì)）人工授粉，通過對(duì)后代單株進(jìn)行抗病位點(diǎn)連鎖標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）、可育株抗性鑒定、結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)和品質(zhì)分析，從中選擇可育株，自交發(fā)展F2代；對(duì)F2代單株根據(jù)上述方式篩選攜帶野生甘藍(lán)抗病QTL、且其他性狀較優(yōu)的個(gè)體自交；在自交后代中繼續(xù)重復(fù)上述篩選，最后獲得攜帶野生甘藍(lán)抗病QTL、育性正常、產(chǎn)量和品質(zhì)相對(duì)較優(yōu)的 Ogu CMS恢復(fù)系材料。

1.3 分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）

以野生甘藍(lán) C01的帶型為參考，利用 4Q292和AC1-4對(duì)前期研究中鑒定到的野生甘藍(lán)所有抗病QTL區(qū)間及側(cè)翼最近SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得7個(gè)在雙親之間存在多態(tài)性的標(biāo)記，涉及3個(gè)葉片抗性位點(diǎn)和2個(gè)莖稈抗位點(diǎn)（表 1）。利用表中標(biāo)記對(duì)各世代單株進(jìn)行分析。盡管其抗病QTL分布在C1、C3、C4、C7和C9等多條連鎖群[11]，但C1和C9聯(lián)鎖群上的2個(gè)QTL（C1-QTL和 C9-QTL）解釋的表型變異度相對(duì)較高（13.6%—24.1%），為主效QTL，且QTL均具有至少2個(gè)連鎖的多態(tài)性標(biāo)記，因此，MAS過程中首要選擇同時(shí)攜帶C1和C9抗病位點(diǎn)，其次考慮是否攜帶C3和C7上QTL連鎖標(biāo)記（對(duì)表型貢獻(xiàn)率相對(duì)較低，且均為單標(biāo)記選擇）。MAS于苗期在每個(gè)世代開展，經(jīng)MAS選中的單株進(jìn)入后期的抗性鑒定、結(jié)實(shí)性調(diào)查和品質(zhì)分析。

1.4 菌核病抗性鑒定

核盤菌菌種為 1980。參照 MEI等[23]的方法進(jìn)行菌種活化、接種體（PDA菌絲塊）制備及菌核病抗性鑒定。于油菜終花期后2周進(jìn)行離體枝稈菌核病抗性鑒定：取一次有效分枝，截取長約30 cm一段，將兩端用保鮮膜纏繞（以防止水分散失），然后轉(zhuǎn)移到可控溫、控濕的室內(nèi)，將枝稈隨機(jī)擺放于鋪好濕毛巾的接種臺(tái)上，并將準(zhǔn)備好的PDA菌絲塊帶菌面緊貼于枝稈上，每枝稈接種2—3個(gè)菌絲塊。接種完，在接種臺(tái)上放上支架，以塑料膜密封，控制溫度（（22±1）℃）和濕度（90%—95%）。接種后第 4天測量菌斑的長度，以相對(duì)于耐病對(duì)照甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)的感病度（S）評(píng)價(jià)材料菌核病抗性，即S=L待測/L對(duì)照（L待測表示材料接種核盤菌的病斑長度（cm），L對(duì)照表示耐病對(duì)照中雙9號(hào)的病斑長度（cm））。

1.5 結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)及籽粒品質(zhì)分析

每個(gè)單株分別選取主花序上連續(xù) 50個(gè)自交角果和離主花序最近且未套袋一次分枝上 50個(gè)自由授粉角果，統(tǒng)計(jì)每角果籽粒數(shù)，分別代表自交和自由授粉結(jié)實(shí)率。用FOSS NIR system3700型近紅外光譜儀檢測自交種籽粒品質(zhì)。光譜掃描條件：分辨率8 cm-1、掃描次數(shù)64次、光譜范圍1 100—2 500 nm、溫度20—25℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

以高抗菌核病的野生甘藍(lán)C01為父本，與編號(hào)為6Y733的白菜雜交，10 d后取子房解剖后進(jìn)行胚挽救及染色體加倍，獲得人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4，其苗期形態(tài)介于野生甘藍(lán)（圖 1-A）和白菜（圖 1-B）之間，與甘藍(lán)型油菜形態(tài)相似（圖 1-C），分子標(biāo)記也表明，AC1-4為B. incana和6Y733的真雜種（圖2）。對(duì)雜種F1進(jìn)行體細(xì)胞染色體觀察發(fā)現(xiàn)，單倍體植株均含19條染色體（圖1-F），經(jīng)染色體加倍的AC1-4植株體細(xì)胞均含有38條染色體（圖1-G）?；ǚ塾澡b定結(jié)果表明，單倍體植株的花粉育性（圖 1-H）遠(yuǎn)低于人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4的花粉育性（可達(dá)80%）（圖1-I）。葉片和枝稈菌核病抗性鑒定結(jié)果（圖1-J和圖1-K）表明，人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4的葉片抗性和枝稈抗性都顯著高于對(duì)照甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)和白菜親本。

圖1 高抗菌核病人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4的特征Fig. 1 Characteristics of AC1-4 (resynthesized Brassica napus) with high resistance against Sclerotinia sclerotiorum

圖2 SSR引物SWU260檢測親本及F1Fig. 2 Verification of the relatives and F1 hybrid individual plants with SSR primer SWU260

人工合成甘藍(lán)型油菜AC1-4與Ogu CMS甘藍(lán)型油菜雜種4Q292（圖1-D）雜交產(chǎn)生的F1代（圖1-E）代共獲得146個(gè)單株，其中69株可育，77株不育。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)1代育性符合1∶1分離，（χ21∶1= 0.17，P＞0.05），符合預(yù)期分離比。對(duì)F1代146個(gè)單株進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，其中128個(gè)單株遺傳了源于抗病甘藍(lán)B. incana的C1-QTL和C9-QTL，另外分布在C3和C7染色體的2個(gè)標(biāo)記也在上述128個(gè)單株中表現(xiàn)出AC1-4與4Q292的雜合帶型。剩余的18個(gè)單株中，有 11個(gè)單株丟失了 C1-QTL，2個(gè)單株丟失了C9-QTL，5個(gè)單株的C3或C7-QTL連鎖標(biāo)記未表現(xiàn)出抗病帶。F1代植株的自交結(jié)實(shí)率與天然結(jié)實(shí)率顯著相關(guān)（r= 0.52），但套袋自交的角果粒數(shù)變異較大，最多達(dá)24粒/角果，最少為5粒/角果，平均為9.07粒/角果。菌核病抗性鑒定表明，含有所有標(biāo)記抗病帶的49個(gè)F1可育單株的相對(duì)感病度S介于0.2—1.4，平均值為0.74，而不完全遺傳上述7個(gè)標(biāo)記抗病帶的6株可育株相對(duì)感病度S介于0.9—1.5，平均值為1.23。結(jié)合結(jié)實(shí)率、分子標(biāo)記結(jié)果以及收獲種子狀況（種子量及飽滿度），選取編號(hào)為4C99和4C115的2個(gè)F1單株進(jìn)入下一輪篩選，2份材料的相對(duì)感病度S分別為0.66和0.40，自交結(jié)實(shí)率分別為12.4和15.0粒/角果，自由授粉結(jié)實(shí)率分別為17.9和21.4粒/角果。

將4C99和4C115的自交種進(jìn)行了夏繁種植，但由于環(huán)境條件的變化，導(dǎo)致大量材料F2單株未開花，最終4C99自交后代有59株開花，4C115有65株開花。對(duì)上述124個(gè)F2單株進(jìn)行C9上枝稈主效抗病QTL連鎖標(biāo)記篩選，發(fā)現(xiàn)源于4C99的59個(gè)F2單株中有35個(gè)植株攜帶 C9-QTL，源于4C115的F2單株中有34個(gè)植株攜帶C9-QTL。由于夏繁地?zé)o抗性鑒定條件，因此，未對(duì)F2代植株進(jìn)行抗性鑒定和篩選。隨后對(duì)可育株上獲得自交種的材料進(jìn)行了籽粒品質(zhì)分析，最終結(jié)合標(biāo)記分析及品質(zhì)分析數(shù)據(jù)篩選了8個(gè)F2，其芥酸含量介于7.50%—24.70%，硫苷含量介于15.88—78.63 μmol·g-1餅粕。利用該8個(gè)F2單株進(jìn)行自交發(fā)展下一代，田間種植共獲得的8個(gè)F2:3家系（以5X進(jìn)行編號(hào)），家系大小介于46—184株。利用分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)家系進(jìn)行分析（表2），F(xiàn)2:3代材料基因型分離明顯，無論是C1還是C9上的QTL在各個(gè)家系中均存在分離，其中4個(gè)家系（5X78、5X80、5X82和5X84）中出現(xiàn)同時(shí)攜帶C1-和C9-QTL的概率（36.6%— 43.5%）顯著高于其他4個(gè)家系（0—8.7%）。8個(gè)家系共計(jì)獲得222株同時(shí)攜帶C1-和C9-QTL的植株。為了進(jìn)一步縮小選擇范圍，利用所有抗病標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行了各家系材料與抗病親本的聚類分析，最終從5X78、5X80、5X81、5X82、5X83和 5X84中分別篩選到 4株、23株、2株、16株、1株和4株（共計(jì)50株）與抗性親本遺傳關(guān)系較近的可育株，而5X77和5X79 2個(gè)家系中沒有發(fā)現(xiàn)與抗性親本聚在一起的植株。對(duì)此50份材料進(jìn)行枝稈菌核病抗性鑒定，同時(shí)以25株完全或部分缺失了抗病QTL的材料作為對(duì)照，結(jié)果顯示，50份材料的相對(duì)感病度S介于0.34—0.89，平均值為0.60，而完全或部分缺失了抗病QTL的植株平均相對(duì)感病度S為0.98，顯著高于前者（P＜0.01）（圖3）。對(duì)部分材料進(jìn)行了籽粒品質(zhì)檢測（表3），發(fā)現(xiàn)所有材料均表現(xiàn)為雙高品質(zhì)。盡管如此，材料之間的硫苷和芥酸含量表現(xiàn)出分離狀態(tài)，個(gè)別材料如5X82-2和 5X82-7的菜籽品質(zhì)已較為接近單低水平，其中5X82-2 的硫苷含量為 45.38 μmol·g-1餅粕，5X82-7 的芥酸含量為6.5%。同時(shí)，這兩個(gè)材料的相對(duì)感病度S分別為0.33和0.48（表3），表明其具有單低的品質(zhì)，且菌核病抗性已得到改良。結(jié)合 MAS和枝稈抗性鑒定結(jié)果，上述材料中相對(duì)感病度S不超過0.5的單株自交種將進(jìn)入下一輪篩選。

表2 各F2:3家系分子標(biāo)記分析結(jié)果Table 2 Results from molecular marker analysis of F2:3 families

圖3 各F2:3家系中選植株的菌核病抗性Fig. 3 The Sclerotinia resistance level of selected individuals in F2:3 families

表3 F2:3家系中部分單株抗性和籽粒品質(zhì)Table 3 Relative susceptibility and seed quality of some individuals in F2:3 generation

3 討論

甘藍(lán)型油菜的遺傳背景因“雙低”選育過程而趨于狹窄，但其二倍體祖先種白菜和甘藍(lán)起源早、栽培歷史悠久，形態(tài)、農(nóng)藝性狀具有豐富的變異[24]。利用甘藍(lán)和白菜培育的人工合成甘藍(lán)型油菜，已被廣泛運(yùn)用到甘藍(lán)型油菜遺傳育種，比如胞質(zhì)雄性不育系“Bro CMS”創(chuàng)制[25]、大粒甘藍(lán)型油菜創(chuàng)制[26]，黃籽甘藍(lán)型油菜品系創(chuàng)制[27-28]、早熟性狀改良[29]、黃萎病抗性的種質(zhì)創(chuàng)建[30]、根腫病抗性改良[31]以及Ogu育性恢復(fù)基因（Rfo）轉(zhuǎn)育[32]等研究中。人工合成甘藍(lán)型油菜與天然甘藍(lán)型油菜遺傳差異大，可有效拓寬天然甘藍(lán)型油菜的遺傳資源。然而，人工合成甘藍(lán)型油菜的含油量較低，芥酸、硫苷含量較高，甚至出現(xiàn)一些源于祖先種的不良性狀，常需要不斷進(jìn)行品質(zhì)改良。本研究所使用的 AC1-4也表現(xiàn)出雙高品質(zhì)，以其為親本發(fā)展的低世代中出現(xiàn)芥酸或硫苷含量較高的材料。后續(xù)研究中，將進(jìn)一步發(fā)展高世代，進(jìn)行雙低品質(zhì)材料的選擇。

Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育敗育徹底、轉(zhuǎn)育容易，是蕓薹屬作物的安全授粉控制系統(tǒng)[1]。甘藍(lán)型油菜 Ogu胞質(zhì)不育系[18-19]及 Ogu CMS的恢復(fù)系[20-22]已成功創(chuàng)建，但目前油菜基因庫中缺乏有效抗源，限制了抗菌核病的油菜Ogu CMS恢復(fù)系的研究。甘藍(lán)型油菜的祖先種甘藍(lán)是改良油菜菌核病抗性的優(yōu)良資源[11,33]。在早期研究中，鑒定到野生甘藍(lán)B. incana具有較好的菌核病抗性[7]，并對(duì)其抗病位點(diǎn)進(jìn)行了QTL定位[11]。利用該材料我們創(chuàng)制了人工合成甘藍(lán)型油菜，該人工合成材料理論上應(yīng)該遺傳B. incana的整套C基因組染色體，因此，該人工合成系與Ogu CMS油菜的雜種F1所有植株理應(yīng)繼承B. incana的抗病QTL位點(diǎn)。然而，利用QTL區(qū)間或側(cè)翼標(biāo)記對(duì)F1代的標(biāo)記分析后發(fā)現(xiàn)，有極少數(shù)單株存在個(gè)別QTL丟失的情況。這可能是由人工合成甘藍(lán)型油菜的遺傳不穩(wěn)定造成的：人工合成甘藍(lán)型油菜含有A、C兩套共線性較高的基因組，減數(shù)分裂時(shí)可能產(chǎn)生A、C染色體之間的異源配對(duì)[34-35]，形成多價(jià)體及單價(jià)體[36-37]，從而導(dǎo)致染色體分離紊亂和非整倍體配子的產(chǎn)生[38-39]，使某些遺傳信息在后代可能丟失。

本研究利用人工合成系和Ogu CMS油菜尋找到7個(gè)與抗病QTL連鎖的多態(tài)性標(biāo)記，涉及4個(gè)染色體上5個(gè)抗病QTL（包括葉片抗性QTL和莖稈抗病QTL）。因此本研究首先采用C1和C9抗病QTL兩側(cè)均有多態(tài)性的標(biāo)記對(duì)材料進(jìn)行分析和選擇，而其他3個(gè)QTL只開放出一個(gè)單標(biāo)記，這些標(biāo)記僅用于輔助選擇和遺傳分析，而用于MAS的準(zhǔn)確性低。油菜及甘藍(lán)的菌核病抗性均為數(shù)量性狀，主要受到加性效應(yīng)控制[11-14,40]，因此，本研究在每個(gè)世代盡量篩選同時(shí)具有C1和C9 QTL、且盡量在其余3個(gè)標(biāo)記結(jié)果中選擇具有抗病甘藍(lán)帶型的個(gè)體。后期的抗性鑒定顯示，標(biāo)記選中的材料平均抗性顯著高于 QTL出現(xiàn)丟失的材料，一定程度證明了標(biāo)記選擇的有效性。

結(jié)合 MAS和抗性選擇，盡管在每個(gè)世代均能鑒定到同時(shí)攜帶多個(gè)抗病QTL且相對(duì)感病度S較低的單株，但是從對(duì) F2:3家系的分析中可以看出，所有家系中的單個(gè)抗病位點(diǎn)均未達(dá)到純合，且硫苷和芥酸含量也表現(xiàn)出分離。但是，將根據(jù) 1.2的選育策略對(duì) F2:3中選擇到的候選植株進(jìn)行進(jìn)一步的選擇，且后期的選擇將注重以家（株）系為單位進(jìn)行分析，以確定目標(biāo)位點(diǎn)及控制育性的核基因Rf是否純合；同時(shí)需要增加家（株）系中個(gè)體數(shù)，從而出現(xiàn)更多的交換重組，從中獲得既具有抗病位點(diǎn)、又具有低硫苷和低芥酸位點(diǎn)的重組個(gè)體；再者，可以考慮通過目前獲得的抗病且芥酸或硫苷含量接近單低的個(gè)體相互雜交，聚合不同性狀的優(yōu)良位點(diǎn)，從而獲得優(yōu)質(zhì)且抗性提高的恢復(fù)株系。

4 結(jié)論

以人工合成甘藍(lán)型油菜為橋梁，野生甘藍(lán)B.incana的菌核病抗性可被有效轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜，從而改良油菜Ogu CMS恢復(fù)材料的菌核病抗性。