基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)糜子SSR標(biāo)記

陳小紅，何杰麗，石甜甜，邵歡歡，王海崗，陳凌，高志軍，王瑞云, ，喬治軍

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801；3山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，太原030031；4內(nèi)蒙古鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古鄂爾多斯017200）

0 引言

【研究意義】糜子（Panicum miliaceumL.）屬于禾本科黍?qū)伲瑸楦珊岛桶敫珊档貐^(qū)粟類作物。糜子起源于中國，在亞洲（印度、日本、不丹、土耳其、斯里蘭卡、伊朗、孟加拉國、阿富汗和黎巴嫩）、非洲（埃及、馬拉維）、歐洲（波蘭、英國、羅馬尼亞、匈牙利、俄羅斯和烏克蘭）、美洲（加拿大、美國、巴西和阿根廷）和大洋洲（澳大利亞、新西蘭）均有分布[1-10]。糜子生育期短、抗旱耐瘠，在干旱環(huán)境中具生產(chǎn)優(yōu)勢，是亞洲國家的糧食作物，在歐洲和美國多用于飼鳥。在中國，糜子曾是華北地區(qū)的主糧，如今僅在山區(qū)和邊遠(yuǎn)地帶栽培；年種植面積約32萬hm2、產(chǎn)量約30萬噸[5]。糜子不僅富含抗性淀粉，可降低血糖和血脂，是保持腸道健康的功能食品；而且還含有木脂素類營養(yǎng)成分，可預(yù)防乳腺癌等多種激素依賴型癌癥和減少心臟病發(fā)生[9]；也是乳糜病患者的理想食品。隨著全球氣溫升高，糜子在旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)、種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和國家糧食安全保障中起的作用日益突顯[2]。目前，全球有糜子種質(zhì)資源29 000余份，中國占9 850份，搞清其遺傳背景是合理高效利用的前提[1,3]。然而，糜子是異源四倍體，基因組信息復(fù)雜，可供準(zhǔn)確評估遺傳差異的分子標(biāo)記缺乏，亟待構(gòu)建一大批SSR以促進(jìn)糜子作物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】2016年，CAVERS等[7]從稱謂、農(nóng)藝性狀描述、經(jīng)濟(jì)價值、地理分布、生活習(xí)性、栽培馴化史、營養(yǎng)生長、生殖發(fā)育、雜交、種群動態(tài)、雜草防控、農(nóng)事操作和病蟲害影響等 13個方面詳細(xì)闡述了加拿大糜子作物的研究近況；WANG等[6]介紹了中國糜子生產(chǎn)概況及資源的遺傳特性。2017年，王瑞云[3]概括了糜子 DNA標(biāo)記的開發(fā)、連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、馴化和傳播等；HABIYAREMYE等[4]介紹了美國糜子的栽培現(xiàn)狀。2018年，刁現(xiàn)民主編著作《中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略研究·谷子糜子分冊》，基于中國糜子的分布和生產(chǎn)，系統(tǒng)探究了糜子生產(chǎn)的分布區(qū)域及產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷程和現(xiàn)狀，翔實總結(jié)了糜子育種、種質(zhì)創(chuàng)新、生物技術(shù)、植物保護(hù)和食品加工等領(lǐng)域研究前沿，深入剖析了中國糜子的生產(chǎn)形勢和產(chǎn)業(yè)發(fā)展中有待改進(jìn)的問題，探究了產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和具體內(nèi)容，提出了產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革形勢下產(chǎn)業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略構(gòu)想及可行建議[2]。2019年，VETRIVENTHAN等[1]調(diào)查了印度國際半干旱熱帶作物研究所（International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics，ICRISAT）基因庫全球糜子資源農(nóng)藝性狀的多樣性，以來自30個國家的849份資源為試驗材料，發(fā)現(xiàn)糜子平均株高62 cm、穗長209 mm，種子顏色共有11種，獲得大粒高產(chǎn)資源2份（IPm2和IPm2661）。上述研究多是基于表型的遺傳多樣性，應(yīng)用基因分型準(zhǔn)確評估資源的研究偏少[10-16]。SSR標(biāo)記在基因組中分布廣、含量豐富、具共顯性且重復(fù)性好，已廣泛應(yīng)用于水稻、小麥等作物的遺傳研究[17-21]。就糜子而言，HU 等[22]和 CHO 等[23]分別首次開發(fā)了46和25個種非特異性和特異性SSR。RAJPUT等[24]檢測548個柳枝稷SSR，發(fā)現(xiàn)339個可用于糜子，其中254個呈多態(tài)性，分辨率為0.25—14.75（平均2.71）。目前，基于轉(zhuǎn)錄組測序挖掘糜子SSR已開展了多項研究[25-31]。王銀月等[25]從4份（3份甘肅和1份山西）糜子資源中挖掘到1 210個SSR，其中116個多態(tài)性較高。連帥等[26]用 63個標(biāo)記評估國內(nèi)外地方品種和野生資源，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)資源遺傳多樣性較國外材料豐富。劉笑瑜等[27]構(gòu)建了 85個可以有效分辨不同基因型的高基元SSR。JIANG等[28]從雁黍5號中發(fā)掘出8 139個EST-SSR，驗證其中24個，發(fā)現(xiàn)21個擴(kuò)增效果好，3個具多態(tài)性，開發(fā)效率為87.5%?？苁缇萚29]對11個SSR標(biāo)記熒光后，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)評估中國糜子的遺傳差異，檢測出的等位變異數(shù)（平均為6.5個）超過傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果（平均為3個）的2倍。石甜甜等[30]用144個（高、低基元分別為64和80個）SSR評估96份國內(nèi)外（國內(nèi)、國外分別為71和25份）糜子資源，發(fā)現(xiàn)北方春糜子區(qū)材料的遺傳多樣性較豐富；主成分分析將試材劃歸6類，均與地理來源一致。何杰麗等[31]檢測200個SSR，發(fā)現(xiàn)80個呈多態(tài)性，開發(fā)效率為40%；引物分辨率（Rp）為0.67—4.67（平均值為2.00）。【本研究切入點】較大宗作物而言，作為小雜糧的糜子研究深度不夠，尤其是可供利用的SSR欠缺，難以全面而準(zhǔn)確分析資源間遺傳差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬開發(fā)一批新的糜子特異性標(biāo)記，明確其引物分辨程度、堿基重復(fù)分布狀況及遺傳參數(shù)高低，為準(zhǔn)確評估糜子遺傳多樣性提供有效的分子檢測工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用地理來源差異較大的6份糜子材料（表1），待幼苗長至三葉期，取葉片約0.3 g，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供SSR引物篩選的糜子材料Table 1 Proso millet accessions for screening SSR primers

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 利用Primer Premier 5.0[32]設(shè)計引物。

1.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 用改良CTAB法[33]提取糜子葉片DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanodropND-1000核酸濃度檢測儀分別檢測 DNA的完整性和濃度，根據(jù) A260/A280和 A260/A230值判斷 DNA純度，A260/A280范圍在 1.7—1.9，A260/A230＞2.0。PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）為 2×MasterMix10 μL、上下游引物各 0.8 μL（終濃度為 0.4 μmoL·L-1）、DNA 模板 1 μL（30—80 ng·μL-1）和 ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序為 94℃ 4 min；94℃ 40 s，退火 40 s，72℃ 8 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 根據(jù)電泳條帶讀取多態(tài)性，用“1、0”分別表示擴(kuò)增條帶的有和無。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)公式Rp = ∑Ib，計算標(biāo)記的分辨率（resolving power，Rp）[34]，其中Ib=1-(2×︱0.5-p︱)，Ib表示等位基因信息量，p表示等位基因出現(xiàn)的次數(shù)。用軟件 PowerMarker 3.25[35]和 PopGen 1.32[36]計算 SSR 遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量和濃度檢測

Nanodrop ND-1000核酸濃度檢測儀檢測到DNA原液濃度為 300—2 200 ng·μL-1，檢測到 A260/A280為1.833—1.905，A260/A230為2.008—2.269。瓊脂糖凝膠電泳檢測糜子葉片基因組DNA，得到清晰明亮的電泳條帶（圖1），說明DNA完整、濃度高。

圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Genetic DNA bands running through agarose gel electrophoresis

2.2 引物的開發(fā)

統(tǒng)計200對引物堿基序列重復(fù)的分布情況（圖2）。單堿基序列重復(fù)引物共 20個，10個（50%）具多態(tài)性（電子附圖 1）；二堿基序列重復(fù)引物 36個，15個（41.67%）具多態(tài)性（電子附圖2）；三堿基序列重復(fù)引物144個，55個（38.19%）具多態(tài)性（電子附圖3）。

圖2 200對引物堿基序列重復(fù)分布Fig. 2 Repeat motif distribution of 200 pairs of primer

200對引物堿基類型共53種，數(shù)量較多的（＞9）有CGG（13）、CGC（13）、GCC（13）、GCC（11）、GCG（11）、A（10）和AG（10）。其中，具多態(tài)性的堿基類型有44種，重復(fù)數(shù)量最多的是CGG（11），無多態(tài)性的堿基類型有35種，AG重復(fù)數(shù)量較多（7）。

2.3 引物篩選及分析

200對SSR引物擴(kuò)增6份地理來源差異較大的糜子材料，80對引物的擴(kuò)增條帶呈多態(tài)性（電子附圖1—電子附圖 3），其中單、二和三堿基序列重復(fù)引物分別為10、15和55對（電子附圖1—電子附圖3）。分析其堿基序列重復(fù)類型如下（圖3—圖5和電子附表1）。

從圖3和電子附表1可以看出，單堿基引物的重復(fù)基元為A（50%）和T（50%）；從圖4和電子附表1可以看出，二堿基引物堿基重復(fù)類型有AG（6）、TC（2）、GC（2）、GA（2）、CA（1）、TA（1）和AC（1）7種，其中AG（40%）數(shù)量最多；從圖5和電子附表1可以看出，三堿基引物堿基重復(fù)類型有24種，包括GGC（7）、GCG（6）、GCC（5）、CGG（4）、TGC（3）、CCG（3）、AGC（3）、CTT（3）、GAA（2）、GCT（2）、CGC（2）、GAG（2）、GAC（2）、ACC（1）、AGG（1）、CAG（1）、CGT（1）、AAG（1）、AAC（1）、TCG（1）、CGA（1）、ATT（1）、CAA（1）和CCA（1），其中GGC、GCG和GCC數(shù)量較多（分別占13%、11%和9%）。

圖3 單核苷酸序列重復(fù)SSR的類型及分布Fig. 3 Type and distribution of mono-nucleotide motif SSR

圖4 二核苷酸序列重復(fù)SSR的類型及分布Fig. 4 Type and distribution of di-nucleotide motif SSR

圖5 三核苷酸序列重復(fù)SSR的類型及分布Fig. 5 Type and distribution of tri-nucleotide motif SSR

2.4 80對引物基元的Rp值分析

從電子附表2可以看出，單堿基重復(fù)引物等位基因大小為50—500 bp，條帶數(shù)為 5（RYW150）—12（RYW108）。RYW105的等位基因條帶最多（12個），位點范圍為50—400 bp。RYW150的條帶最少（5個），位點范圍為 110—500 bp。Rp值的范圍為 0.67（RYW110）—4.67（RYW107），平均為2.07；值介于 0.33（RYW110）—0.67（RYW107），平均為0.51。

從電子附表3可以看出，二堿基重復(fù)引物的等位基因大小為50—500 bp，條帶數(shù)為6（RYW165）—16（RYW141）。RYW141的等位基因條帶最多（16個），位點范圍為100—450 bp。RYW165的等位基因條帶最少（6個）。引物 Rp值為 1.33（RYW114和RYW162）—4.33（RYW166），平均為2.73；值介于0.40（RYW168）—0.78（RYW113），平均為0.59。

從電子附表4可以看出，三堿基重復(fù)引物的等位基因大小為50—500 bp，條帶數(shù)為5（RYW134）—20（RYW140）。RYW140的條帶最多（20個），位點范圍為50—500 bp；RYW134的等位基因條帶最少（5個），位點范圍為 50—250 bp。Rp值為 0.67（RYW91、RYW98、RYW100、RYW118、RYW126、RYW127 和 RYW148）—4.00（RYW102 和 RYW158），平均為1.83；值為 0.33（RYW91、RYW93、RYW98、RYW100、RYW118、RYW121、RYW126、RYW127和 RYW148）—0.83（RYW153），平均為 0.59。其中Rp和值均為最低的引物有RYW91、RYW98、RYW100、RYW118、RYW126、RYW127 和 RYW148。

分析80個SSR的分布頻次（圖6）。Rp值在區(qū)間 0—1、1—2、2—3、3—4和 4—5分別包含 17（21.25%）、36（75%）、11（13.75%）、14（17.5%）和 2（2.5%）個標(biāo)記。其中，1—2標(biāo)記頻次最多，4—5標(biāo)記頻次最少。5個標(biāo)記（RYW107、RYW161、RYW166、RYW115和RYW158）的Rp值信息含量豐富。

2.5 引物多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

分析各類型引物的多態(tài)性及遺傳參數(shù)（電子附表5—電子附表7）。單堿基序列重復(fù)標(biāo)記的觀測等位基因數(shù)為2—3個（平均為2.2000），8個位點產(chǎn)生2個變異，2個位點產(chǎn)生 3個變異；有效等位基因數(shù)為1.8000—2.8800（平均為2.0993）；多樣性指數(shù)為0.6365—1.0776（平均為0.7497）；觀測雜合度為0.1000—1.0000（平均為0.6567）；期望雜合度為0.4848—0.7121（平均為0.5622）；Nei's期望雜合度為0.4444—0.6528（平均為 0.5122）；PIC為 0.3750—0.5355（平均為0.4293）?？梢奟YW150的多態(tài)性最豐富，RYW103和RYW109的多態(tài)性最低。

圖6 80個SSR標(biāo)記的分辨率（Rp值）Fig. 6 Resolving power values of 80 SSR marker in proso millet

二堿基序列重復(fù)標(biāo)記的觀測等位基因數(shù)為 2—3個（平均為2.5333），7個位點產(chǎn)生2個變異，8個位點產(chǎn)生3個變異；有效等位基因數(shù)為1.6000—3.0000（平均為2.2341）；多樣性指數(shù)為0.5623—1.0986（平均為 0.8339）；觀測雜合度為 0.5000—1.0000（平均為 0.8444）；期望雜合度為 0.4091—0.7273（平均為0.4994）；Nei's期望雜合度為 0.3700—0.6667（平均為0.5373）；PIC為0.2392—0.74384（平均為0.4293）?？梢奟YW168的多態(tài)性最豐富，RYW167的多態(tài)性最低。

三堿基序列重復(fù)標(biāo)記的觀測等位基因數(shù)為 2—3個（平均為 2.4727），29個位點產(chǎn)生 2個變異，26個位點產(chǎn)生 3個變異；有效等位基因數(shù)為 1.6000—2.9412（平均為2.2445）；多樣性指數(shù)為0.5623—1.0889（平均為0.8312）；觀測雜合度為0.5000—1.0000（平均為 0.8448）；期望雜合度為 0.4091—0.7333（平均為0.5967）；Nei's期望雜合度為0.3750—0.6600（平均為 0.5438）；PIC為 0.2392—0.7438（平均為 0.3989）?？梢奟YW124和RYW137的多態(tài)性最豐富，RYW144多態(tài)性最低。

3 討論

3.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)率及開發(fā)率

HU等[37]用6個ISJ/長片段隨機(jī)引物（introns splice junction or long random primers）擴(kuò)增32份中國糜子主產(chǎn)區(qū)的材料，檢測到56個DNA片段，其中42個具多態(tài)性、遺傳一致度介于 0.0286—0.4737；聚類結(jié)果表明糜子的粳糯性與地理來源有關(guān)。HU等[22]首次利用46個糜子非特異性SSR分析中國118份糜子材料，檢測到中等水平多態(tài)性等位基因226個，每個引物的等位基因數(shù)介于2—9，且遺傳距離與材料的地理起源呈正相關(guān)。但由于標(biāo)記來自其它作物，通用性低，開發(fā)糜子特異性SSR是準(zhǔn)確評估糜子遺傳多樣性的重要環(huán)節(jié)。CHO等[23]率先構(gòu)建糜子基因組DNA的SSR文庫，篩選143對引物，獲得25個多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)率為17.5%。2014年以來，基于高通量測序手段挖掘了一大批糜子特異性 SSR。王銀月等[25]、王璐琳等[15]和劉笑瑜[27]分別開發(fā)了116、17和85個標(biāo)記，多態(tài)率分別為9.59%、24.28%和56.3%。本研究構(gòu)建標(biāo)記的多態(tài)率為40%，低于劉笑瑜[27]的研究結(jié)果，可能與后者構(gòu)建的SSR堿基序列重復(fù)為高基元有關(guān)；而高于其他研究結(jié)果[15,23,25]，可能與本研究選材來源廣、數(shù)目多有關(guān)。

SSR標(biāo)記開發(fā)率是評估構(gòu)建效率的重要指標(biāo)。就SSR開發(fā)率而言，RAJPUT等[24]和王璐琳等[15]研究結(jié)果分別為 62%和 95.7%，本研究為 88.5%，高于RAJPUT等[24]而低于王璐琳等[15]的研究結(jié)果，一方面，RAJPUT等[24]發(fā)掘的SSR來源于柳枝稷，為非種特異性標(biāo)記，開發(fā)率低于本研究的種特異性標(biāo)記；另一方面，王璐琳等[15]發(fā)掘的SSR為三堿基重復(fù)基元，而本研究標(biāo)記除此外，還包括一、二堿基重復(fù)基元，故開發(fā)率低于前者。

3.2 SSR的Rp值及遺傳多樣性衡量參數(shù)

就糜子作物SSR的Rp而言，以往研究發(fā)現(xiàn)其范圍介于1.00—5.75（平均為3.15）、0.334—4.002（平均為1.51）和0.25—14.75（平均為2.71）[13,24,27]，本研究結(jié)果為 0.67—4.67（平均為 2.00），與上述結(jié)果基本一致；而其他植物如苧麻（Boehmeria niveaL.Gaudich.）、密花石斛（Crotalaria）、檉麻（Dendrobium nobileLindl.）和穿心蓮（Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees）分別為3.22、6.15、6.59和10.8，均高于糜子，可能與不同物種自身的遺傳特性有關(guān)[38-41]。

前人研究表明糜子基因多樣性指數(shù)分別為0.4902、0.6275、0.7708、0.6284和0.8478，PIC值分別為0.4321、0.4855、0.4723、0.5544和0.5874[15,26-27,13,29]，本研究檢測到這兩個指標(biāo)分別為0.8215和0.4215，與以往結(jié)果基本相符。

3.3 SSR的堿基組成

迄今糜子中已經(jīng)開發(fā)出一些SSR，其中二、三堿基重復(fù)引物占比分別為 13%—87.9%和 12.01%—87%[23-25]，本研究結(jié)果為18.75%和68.75%，與以往結(jié)果相符；而以往研究開發(fā)的高基元引物占比僅為9.77%[23]，可見糜子中開發(fā)的SSR多為低基元重復(fù)。

王銀月等[25]篩選1210對引物得到116個多態(tài)性SSR，二、三堿基重復(fù)的分別為 102和 14個，其中AC、GA、AG、CA、TC、AAC、CAA、CAG、CGG和 AAG與本研究結(jié)果一致；另外，本研究還發(fā)現(xiàn)堿基重復(fù)類型T、A、GC、TA、GAG、GCC、CTT、TGC、CGA、TCG、GGC、CGT、GAA、GAC、GCT、GCG、AGC、CGC、CCG、ATT、AGG、CCA和ACC，王銀月等[25]還檢測到重復(fù)類型 GT、CT、TG、ACA、AGA、AGT和 CCT，上述重復(fù)類型差異可能與研究材料不同有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，SSR重復(fù)基序中A/T較普遍，而G/C發(fā)生頻率低，這可能與打破G—C的3個氫鍵比A—T的2個氫鍵需要更高能量有關(guān)[42-44]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得的200對SSR引物中，單堿基序列重復(fù)基元有20個，19個為A/T堿基重復(fù)；篩選出的80個多態(tài)性標(biāo)記中，單堿基序列重復(fù)基序類型都是 A/T，與前人研究結(jié)果基本一致[42,44-45]。

4 結(jié)論

用6份地理來源差異較大的糜子材料檢測200對SSR引物，發(fā)現(xiàn)177對（88.5%）可擴(kuò)增出完整條帶，其中80對擴(kuò)增條帶具多態(tài)性，多態(tài)率為40%。