HPLC 法同時(shí)測(cè)定華佗救心丸中8 種蟾蜍二烯內(nèi)酯

周文莉，祝宇龍，李龍飛，趙 冰，彭 燦?，闞家義

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012； 2.華佗國藥股份有限公司，安徽 亳州236800； 3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥230051）

蟾酥是蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺體的分泌物，白色乳狀液體或淺黃色漿液［1］，是我國常用的一味傳統(tǒng)名貴中藥，主要含有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類［2-3］、蟾毒色胺類、甾醇類等成分，以蟾酥二烯內(nèi)酯類為主。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［4-7］，蟾酥有增強(qiáng)心肌收縮力、麻醉、降壓、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抑制血小板聚集、增加冠狀動(dòng)脈血流等藥理活性，但其毒性也大，用藥不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)［8-10］，故對(duì)其服用劑量有嚴(yán)格要求。

華佗救心丸由蟾酥、人參莖葉總皂苷、牛膽膏粉、人工麝香、珍珠、人工牛黃、冰片、三七膏粉組成［11-13］，其執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑》 第十九冊(cè)（標(biāo)準(zhǔn)文號(hào)WS3-B-3675-98），但目前大多以單一或幾種成分含有量為指標(biāo)來表征其質(zhì)量［14-16］，存在操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)不全面、成本高等缺點(diǎn)，故有必要研究開發(fā)一種簡(jiǎn)便快捷、全面準(zhǔn)確的含量測(cè)定方法。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量，以期對(duì)該制劑質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2489 高效液相系統(tǒng) （美國Waters 公司）；YL-060S 超聲波清洗器（深圳市語路清洗設(shè)備有限公司，360 W，40 kHz）；電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；離心機(jī)（常州市萬豐儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與藥物 酯蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈對(duì)照品（純度≥98%），均購于成都克洛瑪生物科技有限公司。華佗救心丸（批號(hào)201901、201902、201903、201904、201905），由華佗國藥股份有限公司提供。乙腈購于西格瑪奧德里奇（上海） 貿(mào)易有限公司；甲醇購于北京百靈威科技有限公司；乙醇購于上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；水為超純水 （美國Pall 公司純水機(jī)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Scientific C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（A） -乙腈（B），梯度洗脫 （0～2 min，20%～38% B；2～5 min，38%～56% B；5～19 min，56%～66% B；19～19.1 min，66%～20% B；19.1～20 min，20%B）；體積流量0.6 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒它靈對(duì)照品適量，甲醇制成1 mg／mL 貯備液，吸取適量，甲醇稀釋，即得（0.1 mg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取5 批丸劑，研細(xì)，每批取約0.3 g，精密稱定，精密加入20 mL 甲醇，室溫下超聲處理20 min 后取出，冷卻，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，振蕩搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與其前后峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以蟾毒靈峰計(jì)為3 000，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量于量瓶中，甲醇稀釋至刻度，振蕩搖勻，制成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100 μg／mL的系列溶液，精密吸取適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.41%、0.43%、0.42%、0.43%、0.41%、0.44%、0.52%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)201901） 適 量，于2、4、6、12、24、48 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為0.54%、0.52%、0.45%、0.58%、0.46%、0.60%、0.65%、0.61%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constitutents

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取丸劑（批號(hào)201901） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面積RSD 分別為 2.35%、3.47%、3.59%、2.84%、1.46%、1.67%、0.27%、0.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取丸劑（批號(hào)201901） 適量，共6 份，加入“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，日蟾毒他靈、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒它靈、華蟾毒他靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基平均加樣回收率分別 為 98.54%、95.07%、97.45%、99.58%、100.46%、102.59%、98.65%、97.61%，RSD 分別為2.75%、2.46%、1.53%、2.81%、1.42%、1.60%、2.03%、2.19%。

2.3.7 樣品含有量測(cè)定 取5 批丸劑，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取時(shí)間篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、提取時(shí)間（10、20、40、60 min） 對(duì)提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)以甲醇為提取溶劑超聲提取20 min 時(shí)，蟾蜍二烯內(nèi)酯類成分提取效率最高。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了Unitary C18、Thermo Scientific C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） 的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者更理想。然后，考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃），發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)分離效果最佳。

3.3 流動(dòng)相篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了0.15% 磷酸-乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、水-乙腈的分離效果，發(fā)現(xiàn)以水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)色譜峰峰形較好，并且為非酸性溶液，對(duì)儀器損害較小，并按“2.1” 項(xiàng)下比例梯度洗脫，此時(shí)各成分色譜峰分離度均大于1.5，而且峰形完整。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所采用的HPLC 法具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、精密度和重復(fù)性良好的優(yōu)點(diǎn)，能在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定華佗救心丸中華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒它靈、蟾毒靈、沙蟾毒精、蟾毒它靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、華蟾毒它靈的含有量，不僅能有效鑒別該制劑中蟾酥微量成分的有無，也可對(duì)其含有量進(jìn)行全面準(zhǔn)確的檢測(cè)，以期為相關(guān)質(zhì)量控制提供重要保障［17-19］。