硫酸軟骨素及白藜蘆醇對(duì)衰老模型小鼠腸道生態(tài)和大腦認(rèn)知功能的影響

張夢(mèng)樂 陳冬梅 李荷 曾慶平

(1廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；2廣州中醫(yī)藥大學(xué))

隨著人們生活方式的改變和人口老齡化的加劇，以大腦認(rèn)知功能障礙為主要特征的慢性疾病如阿爾茨海默病(AD)等的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年攀升〔1〕。微生物-腸-腦軸是將大腦與腸道功能整合的雙向信息交流系統(tǒng)，并涉及神經(jīng)通路、免疫和內(nèi)分泌機(jī)制，腸道微生物在該雙向信息交流系統(tǒng)中的參與十分活躍且具有一定影響〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與AD的發(fā)病密切相關(guān)，因此通過調(diào)節(jié)腸道菌群來預(yù)防和治療AD已成為AD研究的新方向〔4～6〕。伏彩霞等〔7〕發(fā)現(xiàn)，AD患者炎癥因子、氧化應(yīng)激及胰島素抵抗均與其發(fā)病密切相關(guān)，并且炎癥因子、氧化應(yīng)激會(huì)加重胰島素抵抗，可能促進(jìn)病情進(jìn)展。Kocahan等〔8〕發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥是AD的病因之一。白藜蘆醇作為葡萄、虎杖等多種天然植物中存在的多酚類化合物，具有多種生物學(xué)作用。Miura等〔9〕和Jang等〔10〕發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等作用，易通過血腦屏障。Ahmed等〔11〕發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在AD動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用。然而，目前關(guān)于白藜蘆醇通過改善腸道菌群來改善大腦功能的研究尚未見報(bào)道。推測(cè)白藜蘆醇具有通過調(diào)節(jié)腸道菌群、減少β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集，從而達(dá)到改善大腦認(rèn)知功能的作用。本文探討白藜蘆醇與腸道菌群、大腦認(rèn)知功能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 無特定病原體(SPF)級(jí)快速老化模型小鼠(SAMP8)，雄性，8周齡，體重23～28 g，購(gòu)于至善(北京)健康醫(yī)學(xué)研究院有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK(津)2015-0003。動(dòng)物普通飼料購(gòu)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。白藜蘆醇購(gòu)自Amresco(貨號(hào)10102)；硫酸軟骨素：鄭州安安康食品化工有限公司；小鼠Aβ試劑盒購(gòu)自AndyGene(貨號(hào)AD31399MO)；小鼠尿酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(貨號(hào)C012-1-1)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境 在室溫為23℃，相對(duì)濕度為75%，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h∶12 h的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d，自由飲食和飲水。

1.2.2動(dòng)物分組處理 衰老模型實(shí)驗(yàn)：8周齡SAMP8雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為對(duì)照(N)組、硫酸軟骨素處理(T)組、硫酸軟骨素+白藜蘆醇聯(lián)合處理(CT)組，分別飼喂基礎(chǔ)飼料、基礎(chǔ)飼料+硫酸軟骨素、基礎(chǔ)飼料+硫酸軟骨素+白藜蘆醇。T組和CT組每隔一日灌胃硫酸軟骨素溶液1 g/kg，60 d后在消毒環(huán)境下收集小鼠糞便1 g/只。在繼續(xù)灌胃硫酸軟骨素的基礎(chǔ)上，對(duì)CT組加灌白藜蘆醇45 mg/(kg·d)。N組全程灌胃等量生理鹽水。40 d之后再收集小鼠糞便1 g/只，用于腸道細(xì)菌測(cè)序分析。在完成行為學(xué)測(cè)試后，麻醉處死，取大腦組織進(jìn)行免疫學(xué)及生物化學(xué)檢測(cè)。

1.2.3血清制備 將取得的血液于室溫中凝固30 min，再置于冷凍離心機(jī)中，以4℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液。

1.2.4組織勻漿 取出大腦組織稱重后根據(jù)重量加入一定量的pH值為7.4磷酸緩沖液(PBS)，置于勻漿器中進(jìn)行充分的冰浴勻漿。勻漿液置于冷凍離心機(jī)中，以4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液，-80℃保存。

1.3分析測(cè)試

1.3.1糞菌宏基因組分析 收集糞便后，將樣本送往廣州基迪奧生物有限公司進(jìn)行糞菌宏基因組分析。16 S核糖體RNA(16 S rRNA)包括了10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域，其中保守區(qū)在細(xì)菌間差異不大，而高變區(qū)具有屬或種的特異性。所以，16 S rDNA可以成為鑒定物種的特征核酸序列，是最適于細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定的指標(biāo)。

樣品總DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、文庫(kù)制備及庫(kù)檢、上機(jī)測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)，再對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切過濾拼接成Tags，接下來過濾目標(biāo)片段并聚類成為操作分類單元(OTU)。首先根據(jù)得到的總OTU，統(tǒng)計(jì)分析其中共有及特有的 OTU，接下來再進(jìn)行OTU物種注釋，從而得到每個(gè)樣品不同水平的群落組成信息。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)衰老模型大腦組織的Aβ 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，重復(fù)3次，取各孔的平均吸光度(OD值)。

1.3.3酶比色法檢測(cè)衰老模型大腦組織的尿酸含量 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，重復(fù)3次，取各孔的平均吸光度(OD值)。

1.3.4Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試包括前6 d的定位航行實(shí)驗(yàn)和第7天的空間搜索實(shí)驗(yàn)，主要用于測(cè)試空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，每只小鼠每天訓(xùn)練4次，每次120 s，平臺(tái)停留時(shí)間設(shè)3 s，隨機(jī)選擇一個(gè)象限，將小鼠面向池壁放入水中，記錄其尋找平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。如在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)并且停留3～5 s。每只小鼠共計(jì)訓(xùn)練24次，計(jì)算每天各組4次逃避潛伏期的平均值?？臻g搜索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量記憶能力。第7天撤去平臺(tái),任選一個(gè)標(biāo)記物將動(dòng)物放人水中，測(cè)量其120 s在目標(biāo)象限的時(shí)間、游泳速度和穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。并選用Graphpad prism軟件完成作圖。

2 結(jié) 果

2.1硫酸軟骨素和白藜蘆醇對(duì)衰老模型小鼠腸菌組成的影響 由圖1可知，小鼠在接受硫酸軟骨素或硫酸軟骨素+白藜蘆醇處理之后腸道菌群發(fā)生了明顯的變化。T組有害的促炎性脫硫弧菌豐度均有不同程度升高。相反，CT組則脫硫弧菌豐度降低。其次，T組CT1小鼠腸道有益的抗炎性梭菌豐度低于CT組CT2小鼠。另外，CT組CT2小鼠抗炎性毛螺菌高于T組CT1小鼠，見圖1。

N為對(duì)照組，T1為接受硫酸軟骨素處理60 d；T2為T1再接受硫酸軟骨素40 d；CT1為接受硫酸軟骨素處理60 d；CT2為CT1再接受硫酸軟骨素和白藜蘆醇處理40 d圖1 白藜蘆醇、硫酸軟骨素對(duì)衰老小鼠腸道菌群的影響

2.2硫酸軟骨素和白藜蘆醇對(duì)SAMP8小鼠行為學(xué)測(cè)試指標(biāo)的影響 第3天開始，T組逃避潛伏期明顯高于N組，而CT組逃避潛伏期整體趨勢(shì)低于T組，見表1。

在第7天的空間搜索實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，T組平均速度、穿越平臺(tái)次數(shù)及在目標(biāo)象限內(nèi)的時(shí)間均低于N組，表明該組小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力低于N組。CT組平均速度、穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限內(nèi)的時(shí)間均高于T組，說明白藜蘆醇具有提高快速老化模型小鼠學(xué)習(xí)和空間記憶能力的作用。其中T組平均速度顯著低于N組和CT組(均P<0.05)。見表2。

表1 各組定位航行試驗(yàn)潛伏期

與N組比較：1)P<0.05;與T組比較：2)P<0.05；下表同

表2 各組空間探索實(shí)驗(yàn)

2.3硫酸軟骨素和白藜蘆醇對(duì)衰老模型小鼠大腦Aβ、尿酸水平的影響 T組Aβ、尿酸水平顯著低于N組和CT組(P<0.05)，而CT組Aβ表達(dá)及尿酸水平顯著低于N組(均P<0.05)，見表3。

表3 各組尿酸和Aβ比較

3 討 論

大腦認(rèn)知功能障礙是AD的主要癥狀之一，因該病的難以基本治愈等現(xiàn)狀給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。隨著對(duì)腸道菌群研究的逐漸深入，越來越多的研究結(jié)果表明腸道菌群與AD密切相關(guān)〔12～14〕。梭菌為短鏈脂肪酸(SCFAs)產(chǎn)生菌，在腸道中可產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等。研究表明，SCFAs可通過調(diào)控Toll樣受體(TLR)4/髓樣分化因子(My)D88/腫瘤壞死因子相關(guān)因子(TRAF)6/核因子(NF)-κB炎癥通路抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用〔15〕。毛螺菌科在微生物學(xué)分類中屬于厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目，Han等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)毛螺菌科可能通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞內(nèi)乙酰化組蛋白H3水平，調(diào)控Treg的免疫平衡，而Treg細(xì)胞在腸道穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)非常豐富，有助于維持腸道和免疫系統(tǒng)穩(wěn)定。脫硫弧菌為硫酸鹽還原菌，當(dāng)其在腸道中大量存在時(shí)，會(huì)過度降解腸壁黏液素，使腸壁變薄形成腸漏，LPS滲漏入血再透過血腦屏障進(jìn)入到大腦當(dāng)中，導(dǎo)致大腦產(chǎn)生感染性炎癥〔17〕。以上結(jié)果表明，硫酸軟骨素處理小鼠的促炎性腸菌豐度較高，而抗炎性腸菌豐度較低。相反，經(jīng)白藜蘆醇處理后，促炎性腸菌豐度降低，抗炎性腸菌豐度升高。

AD在神經(jīng)病理學(xué)上以細(xì)胞壁、神經(jīng)元表面的淀粉樣蛋白沉積與神經(jīng)纖維纏結(jié)為特征，作為老年斑主要成分的Aβ在AD的形成與發(fā)展中都扮演著重要的角色。Aβ的前體淀粉樣蛋白(APP)為神經(jīng)元跨膜蛋白，其作用為促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、存活和損傷后修復(fù)。Bourgade等〔18〕發(fā)現(xiàn)Aβ對(duì)單純皰疹病毒(HSV)-1和甲型流感病毒感染大腦有保護(hù)作用，Kumar等〔19〕發(fā)現(xiàn)Aβ能抗大腦內(nèi)細(xì)菌及真菌感染。當(dāng)LPS透過血腦屏障進(jìn)入大腦時(shí)，APP被切割產(chǎn)生Aβ用以清除炎癥。然而，Aβ又可以經(jīng)LPS-TLR4/糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)雙通路激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起神經(jīng)炎癥，且硝基化動(dòng)力激素相關(guān)蛋白-1和硝基化胰島素降解酶的S-硝基化又使Aβ無法被降解，最終Aβ進(jìn)入線粒體，引起線粒體功能障礙，釋放過多活性氧簇，使神經(jīng)元早衰死亡〔20〕。一旦神經(jīng)元死亡數(shù)量超過閾值就會(huì)導(dǎo)致AD發(fā)生，而神經(jīng)元死亡是LPS入腦和氧化應(yīng)激的必然結(jié)果。Aβ和尿酸分別與LPS含量及氧化應(yīng)激程度成正比，本文推測(cè)，SAMP8小鼠處于老年?duì)顟B(tài)，免疫力低下，當(dāng)用硫酸軟骨素灌胃時(shí)，誘導(dǎo)了硫酸脂酶分泌菌及硫酸還原菌過度生長(zhǎng)〔21，22〕。在腸道受損條件下，LPS外泄誘發(fā)大腦神經(jīng)炎癥。反之，白藜蘆醇可能通過調(diào)整腸道菌群、避免腸壁損傷和脂多糖外漏，減少Aβ生成與聚集，從而發(fā)揮改善大腦認(rèn)知功能的作用。